$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Мечение SBDS-FlAsH флуоресцентным красителем FlAsH 4',5'-Bis(1,3,2 дитиоарсолан-2-ил) флуоресцеином
- Смешайте 3 нмоль белка SBDS-FlAsH (FlAsH-метка соответствует мотиву тетрацистеина Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, генетически сконструированному в С-конце рекомбинантного белка SBDS) с 3 нмоль флуоресцеинового красителя 4',5'-бис(1,3,2 дитиоарсолан-2-ил) в объеме 5 мкл анизотропного буфера (50 мМ Tris-HCl pH 7,5, 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 10% глицерина, 5 мМ β-меркаптоэтанол).
- Дайте реакции протекать в течение 8 часов при 4 °C. Диализируйте образец в буфере анизотропии на ночь, чтобы удалить свободный краситель.
- Используйте закон Ламберта-Бира для количественной оценки % меченого белка. Измерьте поглощение на длинах волн 280 нм и 508 нм в спектрофотометре с помощью кварцевой кюветы соответствующего объема. заметка: Учитывайте следующие молярные коэффициенты поглощения (M-1 см-1):
Уравнение 1
- Рассчитайте концентрацию меченого белка SBDS-FlAsH с помощью уравнения 2.
Уравнение 2
- Рассчитайте концентрацию общего белка SBDS с помощью уравнения 3, подставив рассчитанный CSBDS-FlAsH из предыдущего шага.
Уравнение 3
- Рассчитайте процентное содержание меченого белка с помощью уравнения 4,
Уравнение 4
2. Эксперименты с флуоресцентной анизотропией
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты по анизотропии проводились на спектрофлуориметре, оснащенном набором инструментов для поляризации, а сбор данных осуществлялся с использованием программы анизотропии, предусмотренной в программном обеспечении оборудования. Длина волны возбуждения была установлена на длине волны 494 нм с шириной спектральной полосы 8 нм, а излучение регистрировалось с помощью полосового фильтра 530±25 нм. Измерения проводились при температуре 25 °C в кювете объемом 200 мкл с длиной пути 5 мм.
- Во флуоресцентной кювете поместите 200 мкл 30 нМ SBDS-FlAsH в анизотропный буфер и титруйте 2 мкл 30 мкМ EFL1. Тщательно перемешайте и дайте реакции постоять 3 минуты, прежде чем измерять значение анизотропии.
- Повторяйте шаг 2.1 до тех пор, пока общий объем EFL1 не составит 40 мкл.
3. Анализ данных
- Подгонка данных к соответствующей модели привязки с помощью нелинейного алгоритма регрессии по методу наименьших квадратов. Уравнения для наиболее распространенных моделей связывания представлены в таблице 1.
- Оцените наилучшую модель, описывающую взаимодействие между белками, изучив остатки посадки. Подкрепите выбранную модель дополнительными экспериментами.
Таблица 1. Общие модели связывания белок-белковых взаимодействий и математические уравнения, которые их описывают.
