Электрофоретический анализ сдвига подвижности для обнаружения комплексов транскрипционный фактор-ДНК

Аннотация

Источник: Hsieh, Y. W. et al., Оптимизированный протокол для анализа сдвига электрофоретической подвижности с использованием инфракрасных флуоресцентных меченных красителем олигонуклеотидов. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео мы демонстрируем анализ сдвига электрофоретической подвижности для обнаружения взаимодействий белка и ДНК с помощью инфракрасных флуоресцентных зондов ДНК. Когда белок связывается с зондом ДНК, он образует большой комплекс, который медленно мигрирует дальше и выглядит как смещенная полоса на геле.

Протокол

1. Реакция связывания и электрофорез

1. Приготовьте 1 мл 5-кратного связывающего буфера, смешав 50 мкл 1 М Tris-HCl, pH 7,5; 10 мкл 5 M NaCl; 200 мкл 1 M KCl, 5 мкл 1 M MgCl₂, 10 мкл 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 мкл 1 M DTT; 25 мкл 10 мг/мл BSA, и 695 мкл ddH₂O.
   заметка: Буфер для связывания 5x может быть аликвотирован и храниться при температуре -20 °C. Еще один момент, который следует учитывать, заключается в том, что различные факторы транскрипции будут иметь разные модификации связывающего буфера.
2. Непосредственно перед настройкой реакций связывания предварительно запустите 5% нативный пол....

Результаты

Рисунок 1. fEMSA с использованием олигонуклеотидов, меченных инфракрасными флуоресцентными красителями. (А) Блок-схема fEMSA. (B) Влияние бромфенолового синего красителя, оранжевого G и dI-dC (1 мкг) на fEMSA. Использовали 5 нМ зонда 5'Dye-LIM-4/SOX-2. (C)fEMSA, демонстрирующая специфичность связывания 6xHis-SOX-2^G73E с сайтом-мишенью SOX-2 элемента LIM-4/SOX-2. Использова.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
30% раствор акриламида/биса, 37,5:1	Био-Рад	1610158	Акриламид вреден и токсичен.
Бычья сыворотка Альбумин молекулярно-биологической степени	Биолаборатории Новой Англии	В9000С
5'IRDye700-меченые олигос ДНК	Интегрированные технологии ДНК	Пользовательский DNA oligo	В рукописи они называются 5'-мечеными красителями или инфракрасными флуоресцентными ДНК-олигополигенами. Компания будет специально синтезировать 5'-меченые IRDye ДНК-олигонуклеотиды. Требует синтеза накипи не менее 100 мкМ и очистки ВЭЖХ.
Ячейка вертикального электрофореза Mini-PROTEAN	Био-Рад	1658000ФК	устройство
Инфракрасная система визуализации Odyssey CLx	LI-COR Биотехнология	Инфракрасная система Odyssey CLx Imagng	устройство
Система визуализации Odyssey Fc	LI-COR Биотехнология	Двухрежимная система визуализации Odyssey FC	устройство
Программное обеспечение Image Studio (версия 4.0)	LI-COR Биотехнология	Программное обеспечение Image Studio	программное обеспечение
Оранжевый G	Сигма-Олдрич	О3756-25Г	химический
6x Оранжевый загрузочный краситель			0,25% апельсина G; 30% глицерина
0,5x TBE			45 мМ Трис-Борат; 1 мМ ЭДТА
1x TE			10 мМ Tris-HCl; 1 мМ ЭДТА, pH8.0
1x STE			100 мМ NaCl; 10 мМ Tris-HCl, pH8.0; 1 мМ ЭДТА
5x буфер привязки			50 мМ Tris-HCl, pH7.5; 50 мМ NaCl; 200 мМ KCl; 5 мМ MgCl2; 5 мМ ЭДТА, pH8.0; 5 мМ DTT; 250 мкг/мл БСА