$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Реакция связывания и электрофорез
- Приготовьте 1 мл 5-кратного связывающего буфера, смешав 50 мкл 1 М Tris-HCl, pH 7,5; 10 мкл 5 M NaCl; 200 мкл 1 M KCl, 5 мкл 1 M MgCl2, 10 мкл 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 мкл 1 M DTT; 25 мкл 10 мг/мл BSA, и 695 мкл ddH2O.
заметка: Буфер для связывания 5x может быть аликвотирован и храниться при температуре -20 °C. Еще один момент, который следует учитывать, заключается в том, что различные факторы транскрипции будут иметь разные модификации связывающего буфера.
- Непосредственно перед настройкой реакций связывания предварительно запустите 5% нативный полиакриламидный гель в 0,5x TBE + 2,5% глицерина для удаления всех следов персульфата аммония при 80 В в течение 30 - 60 минут или до тех пор, пока ток не перестанет меняться со временем.
- Настройте реакцию связывания в конечном объеме 20 μл.
- Смешайте 4 мкл 5-кратного связывающего буфера, 80 - 200 нг очищенного белка А (в 50% глицерина, т.е. SOX-2), 1 мкл 0,1 мкМ конъюгированного с краителем зонда (конечная концентрация: 5 нМ) и ddH2O.
- Дополнительно: Если требуются конкуренты с холодным щупом, добавьте различные концентрации (2x, 10x, 25x, 50x, 100x и т.д.) холодных зондов.
- Дополнительно: Когда проверяется взаимодействие между белками А и В (т.е. SOX-2 и LIM-4), добавьте 80 - 200 нг очищенного белка В (с 50% глицерина, т.е. LIM-4).
- Необязательно: Если используется препарат ядерного экстракта и необходимо проверить специфическое связывание белка А, добавьте антитело, специфичное к белку А (т.е. анти-6xHis, анти-ФЛАГ и т.д.).
- Инкубировать при R/T в темноте в течение 15 минут.
- Загрузите все реакции связывания на гель и запустите гель со скоростью 10 В/см на нужное расстояние.
2. Визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Гель был отсканирован непосредственно в стеклянных пластинах с помощью усовершенствованной инфракрасной системы визуализации. Таким образом, гель можно рассасывать дальше и сканировать повторно (рисунки 1С и 2). Для сканирования геля также была протестирована флуоресцентная система визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне, предназначенная в первую очередь для вестерн-блоттинга, но только передовая инфракрасная система визуализации смогла отсканировать гель с хорошим разрешением. Описанная методология специфична для конкретного программного обеспечения для инфракрасной визуализации, хотя могут использоваться и другие пакеты программного обеспечения.
- Очистите станину сканера с помощью ddH2O и хорошо высушите перед сканированием. Вытрите насухо стеклянные пластины геля и поместите пластины с гелем на стол сканера.
- Откройте программу для инфракрасной визуализации и перейдите на вкладку «Получить». Когда более тонкая пластина (1 мм) будет размещена на станине сканера, используйте следующие настройки: Канал: 700, Интенсивность: Авто, Разрешение: 169 мкм, Качество: среднее, и Смещение фокуса: 1,5 мм. Когда более толстая пластина (3 мм) будет размещена на станине сканера, используйте следующие параметры: Канал: 700, Интенсивность: Авто, Разрешение: 84 мкм, Качество: среднее, и Смещение фокуса: 3,5 мм. Смещение фокуса зависит от толщины стеклянной пластины.
- Выберите область, которую занимает гель на сканере. Нажмите «Начать», чтобы начать сканирование.
