Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Очистка PDGFRα положительных клеток линии олигодендроцитов из мозга мыши (модифицировано на основе ранее описанных протоколов иммунопанорамирования)
- Приготовление иммунопанорамной пластины для отбора PDGFRα-положительных клеток и 2 пластин для истощения эндотелиальных клеток и микроглии.
заметка: Обратите внимание, что чашки Петри, но не чашки для клеточных культур, подходят для эксперимента по иммунопанорамированию; Если очищенные клетки будут использоваться для культивирования, необходимо провести этапы иммунопанорамирования в шкафу биобезопасности
- Покройте 10-сантиметровую пластину Петри 30 мкл козьего антикрысиного IgG в 10 мл pH 9,5, 50 мМ Tris-HCl на ночь при 4 °C. Перемешайте пластину, чтобы убедиться, что поверхности пластин равномерно и полностью покрыты раствором для покрытия.
- Приготовьте раствор антитела PDGFRα путем разведения 40 мкл антитела крысы против PDGFRα с 12 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS), содержащего 0,2% BSA.
- После 3 промываний планшета, покрытого IgG, по 10 мл 1x DPBS каждое, инкубировать планшет, покрытый IgG, с раствором антитела PDGFRα при комнатной температуре в течение 4 ч.
- Промойте крысу пластину, покрытую антителами против PDGFRα, 3 раза по 10 мл 1x DPBS каждая. Аккуратно нанесите раствор DPBS вдоль боковой стенки плиты и не потревожьте окрашенные поверхности.
- Покройте 2 новые 15-сантиметровые пластины Петри для истощения эндотелиальных клеток и микроглии 20 мл DPBS, содержащими 2,3 мкг/мл лектина Banderiaea simplicifolia lectin 1 (BSL-1) в течение 2 ч.
- Промойте пластины с покрытием BSL-1 3 раза 20 мл 1x DPBS. Аккуратно нанесите раствор DPBS вдоль боковой стенки плит и не нарушайте окрашенные поверхности.
- Очистка PDGFRα-положительных клеток линии олигодендроцитов модифицирована по сравнению с ранее опубликованными методами.
- Препарируйте корковые ткани мозга 2 постнатальных суток на 7-й день (P7) мыши в соответствии с ранее опубликованными протоколами.
- Диссоциируйте ткани для получения суспензии одиночных клеток с помощью набора для диссоциации нервной ткани (P) в соответствии с подробными инструкциями производителя.
- Кратко разрежьте рассеченные корковые ткани на кусочки скальпелем и подвергните их ферментативному перевариванию при 37 °C. После разложения вручную диссоциируйте кусочки с помощью пипеток Пастера из полированного пламенем стекла в одноклеточную суспензию.
- Центрифугируйте суспензию одиночных клеток при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре и суспензируйте клеточную гранулу, используя 15 мл иммунопанирующего буфера (иммунопанирующий буфер представляет собой DPBS с 0,02% БСА и 5 мкг/мл инсулина).
- Инкубируйте суспензию одиночных клеток из 2 мозгов мышей последовательно на 2 планшетах, покрытых BSL-1, в течение 15 минут при комнатной температуре с легким перемешиванием планшета каждые 5 минут для обеспечения лучшего истощения микроглии и эндотелиальных клеток.
- Осторожно покрутите планшет, чтобы собрать неадгезивные клетки в клеточной суспензии, и инкубируйте их на пластине, покрытой антителами rat-PDGFRα, в течение 45 минут при комнатной температуре.
- После инкубации клеточной суспензии на пластине, покрытой антителами крысы-PDGFRα, осторожно поверните пластину для сбора клеточной суспензии и промывайте пластину 8 раз DPBS для избавления от неадгезивных клеток. Аккуратно нанесите промывочный раствор вдоль боковой стенки пластины и несколько раз перемешайте пластину, чтобы избавиться от неадгезивных клеток.
- Отделите клетки от пластины, покрытой антителами rat-PDGFRα, с помощью 4 мл раствора для удаления клеток в течение 10 минут при 37 °C. Встряхните пластину, чтобы выбить адгезивные клетки.
- Соберите очищенные OPC путем центрифугирования при 300 x g при комнатной температуре, суспензируйте клеточную гранулу 2 мл среды для культивирования клеток OPC и подсчитайте клетки с помощью трипанового синего и гемоцитометра (500 мл клеточной питательной среды в среде DMEM/F12, содержащей 5 мл раствора пенициллин-стрептомицина (P/S), 5 мл N2, 10 мл B27, 5 мкг/мл инсулина, 0,1% BSA, 20 нг/мл bFGF и 10 нг/мл PDGFRα).
- Валидация чистоты OPC после иммунопанирования.
- Чтобы оценить обогащение ОПЦ после иммунопанирования, используйте часть очищенных ОПЦ для экстракции РНК с экстракцией на основе тиоцианата гуанидии в соответствии с инструкциями производителя.
- Проводите кОТ-ПЦР с использованием мастер-смеси флуоресцентного зеленого красителя для проверки обогащения экспрессии PDGFRα в очищенных OPC по сравнению с диссоциированными клетками мозга согласно ранее опубликованным материалам.
- Кроме того, засемените некоторые очищенные OPC в 24-луночные планшеты, покрытые поли-D-лизином, для иммуноокрашивания антителом к протеогликану (NG2) хондроитин сульфата (NG2) в соответствии с ранее опубликованными материалами.
2. Подготовка низкосотового ChIP и построение библиотеки ChIP для высокопроизводительного секвенирования
- Препарат Olig2 Low-cell ChIP с коммерчески доступной ультразвуковой системой и коммерчески доступным комплектом ChIP с низким номером клеток (см. Таблицу материалов), следуя подробным стандартным процедурам из инструкций производителя.
- После отделения от крысы планшета, покрытого антителами к PDGFRα, и подсчета клеток с помощью трипанового синего и гемоцитометра помещали 20 000 очищенных OPC в среду для культуры клеток OPC объемом 1 мл для каждой реакции ChIP.
- Добавьте 27 мкл 36,5% формальдегида для фиксации клеточной суспензии на 10 мин при комнатной температуре.<бр/>
осторожность: Обратите внимание, что в целях безопасности в вытяжном шкафу для химических веществ необходимо использовать формальдегид.
- Прекратить сшивание ДНК-белков 50 μл 2,5 М глицина на 5 мин при комнатной температуре.
заметка: С этого момента все действия необходимо проводить на льду или в холодном помещении с температурой 4 °C.
- Промойте гранулы сшитых клеток 1 мл ледяного сбалансированного солевого раствора Ганкса (HBSS) с коктейлем ингибиторов протеазы и получите гранулы клеток с помощью предварительно охлажденной центрифуги при 300 x g при 4 °C.
- Лизировать клеточную гранулу в 25 мкл полного буфера для лизиса в течение 5 минут на льду.
заметка: Перемешивайте пробирку, чтобы суспендировать клетки в буфере для лизиса.
- Дополните клеточный лизат 75 мкл ледяным HBSS, содержащим коктейль ингибиторов протеазы, и срежьте хроматин клеточного лизата с помощью предварительно охлажденной ультразвуковой системы с 5 циклами по 30 с ON и 30 s OFF. Всегда проводите ультразвуковую обработку 6 трубок вместе и убедитесь, что балансировочные трубки содержат 100 μл воды.
- После сдвига центрифугируйте при 14 000 x g в течение 10 минут при 4 °C и соберите надосадочную жидкость в новую пробирку после центрифугирования.
- Разбавьте 100 мкл сдвигаемого хроматина равным объемом ледяного полного буфера ChIP с ингибитором протеазы.
- Сохраните 20 мкл разбавленного сдвигового хроматина в качестве входного контрольного образца.
заметка: Также требуется входной контрольный образец для сравнения с иммунопреципитированным образцом Olig2 для идентификации иммунопреципитированной ДНК антител Olig2.
- Добавьте 1 мкл кроличьего анти-олиг2 антитела к 180 мкл разбавленного сдвигового хроматина и инкубируйте реакционную пробирку на вращающемся колесе при 40 об/мин в течение 16 ч при 4 °С.<бр/>
заметка: Выполняйте этот этап в холодном помещении.
- Для каждой реакции ChIP промойте 11 мкл шариков, покрытых магнитным белком А, буфером для промывки шариков объемом 55 мкл и после 2 стирок поместите гранулы в 11 мкл буфера для промывки шариков.
заметка: Выполняйте этот этап в холодном помещении.
- Для каждой реакции ChIP добавьте 10 μL предварительно промытых шариков, покрытых белком А, в реакционную пробирку ChIP. Выполняйте этот этап в холодном помещении.
- Инкубируйте реакционную трубку ChIP при температуре 4 °C еще 2 ч на вращающемся колесе.
- Поместите реакционную трубку ChIP на магнитный штатив на 1 мин.<бр/>
заметка: Выполняйте этот этап в холодном помещении.
- Удалите надосадочную жидкость и не смещайте шариковую гранулу.
- Промойте гранулу гранул по 100 мкл для каждого из 4 буферов промывки соответственно в течение 4 минут на вращающемся колесе при температуре 4 °C.
- После промывки добавьте 200 мкл элюирующего буфера в гранулу гранул и инкубируйте реакционную пробирку ChIP при температуре 65 °C в течение 4 ч для обратного сшивания белка-ДНК.
- Кроме того, добавьте 180 мкл элюирующего буфера к контрольному образцу объемом 20 мкл и инкубируйте при 65 °C в течение 4 ч для обратного сшивания белка-ДНК.
- Добавьте 200 μL 25:24:1 (v/v) смесь фенола, хлороформа и изоамилового спирта в каждую реакционную пробирку ChIP.
- Энергично перемешайте в течение 1 минуты и центрифугируйте при 13 000 x g в течение 15 минут при комнатной температуре. Перенесите верхнюю фазу в новую трубку.
- Добавьте 40 мкл 3 М раствора ацетата натрия, 1000 мкл 100% этанола и 2 мкл гликогенового осадка, ковалентно связанного с синим красителем, в каждую реакционную пробирку ChIP на ночь при -20 °C.
- Центрифуга при 13 000 x g в течение 20 мин при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость, промойте 500 мкл холодным 70% этанолом и центрифугируйте при 13 000 x г в течение 20 минут при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость, оставьте гранулу сухой на воздухе в течение 10 минут и растворите гранулу в 50 μл воды.
- Построение библиотеки ChIP для высокопроизводительного секвенирования
- Очистите и сконцентрируйте ДНК ChIP с помощью набора для очистки в соответствии с инструкциями производителя.
- Количественно оцените образец ChIP с помощью пико-зеленого цвета в соответствии с инструкциями производителя.
- Используйте комплект ChIP-seq для Т-образного хвоста, репликации и хвоста, переключения и расширения шаблонов, добавления адаптеров и усиления, выбора размера библиотеки и очистки в соответствии с инструкциями производителя.
- После денатурации дцДНК дефосфорилировать 3'-конец одноцепочной ДНК с помощью щелочной фосфатазы креветок и добавить поли(Т)-хвост к одноцепочечной ДНК с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы.
- Отжгите праймер DNA Poly (dA) к матрице одноцепочной ДНК для репликации ДНК и переключения матриц.
- После переключения шаблонов амплифицируйте библиотеку ChIP-seq методом ПЦР с помощью прямого и обратного праймеров для индексации.
- Выберите библиотеку ChIP-seq с амплификацией ПЦР с фрагментами в диапазоне от 250 до 500.о. с помощью парамагнитных шариков по варианту 2 для выбора двойного размера.
- Проверьте качество выбранной библиотеки ChIP-seq с помощью микрофлюидного чип-капиллярного электрофореза.
