1. Поляризационная микроскопия
- Для широкопольного лазерного излучения сфокусируйте линию непрерывного диодного лазера с длиной волны 638 нм (40 мВт) на апертуре многомодового оптического волокна для очистки луча. Установите линейный поляризатор на выходе волокна, чтобы задать поляризацию лазерного света.
- Блокируйте возбуждающую составляющую излучаемого света с помощью дихроичного зеркала (отсечка 640 нм) и полосового фильтра (полоса пропускания 700/75).
- Пусть сигнал флуоресценции проходит через поляризационный светоделитель, который расщепляет излучаемый свет на перпендикулярную и параллельную поляризованные составляющие. Затем сфокусируйте неотраженный луч (параллельную составляющую) и отраженный луч (перпендикулярную составляющую) с помощью ахроматической линзы с фокусным расстоянием 200 мм на микросхеме ЭМ-ПЗС-камеры с обратной подсветкой (рис. 1b и 1c). С помощью зеркала отрегулируйте направление перпендикулярного луча по отношению к линзе.
2. Разработка и тестирование флуоресцентно-меченого референсного олигомера ДНК
- Определение последовательности ядра референсной ДНК: метод основан на конкурентном анализе, который измеряет константу диссоциации (KD2) между транскрипционным фактором и немеченым конкурирующим олигомером ДНК, конкурирующим за связывание с флуоресцентно меченой ДНК, сродство которой с TF выступает в качестве референса (KD1). Консенсусная последовательность, полученная из других источников, таких как след ДНКазы или бактериальный 1-гибрид, может служить отправной точкой.
заметка: Как правило, подходящая референсная ДНК имеет от 3 до 7 раз меньшую аффинность связывания с TF по сравнению с консенсусной последовательностью.
- Измерьте с помощью HiP-FA KD1s 2-3 предварительных одиночных мутаций консенсусной последовательности, полученных на предыдущем этапе. Старайтесь изменять позиции в согласованных последовательностях, которые не слишком специфичны, чтобы избежать полной потери привязки.
заметка: Важно, чтобы референсная последовательность была связана интересующим фактором транскрипции (мы использовали в этом протоколе Giant Gt), но не слишком сильно, чтобы более слабые конкуренты могли вытеснить его при высоких концентрациях.
- Расширьте основной мотив (обычно 8-12 пар оснований) до длины 16 пар оснований или более, добавив симметрично фланкирующую последовательность с обеих сторон (добавьте боковые цепочки для правильного связывания). При необходимости (например, для более длинных связывающих доменов) используйте более длинные последовательности (до ~50 пар оснований в длину были протестированы с помощью анализа HiP-FA).
осторожность: Будьте осторожны и не добавляйте основания, которые, как ожидается, создадут эктопические сайты связывания. Для облегчения этого процесса используйте вычислительные инструменты, которые предсказывают сайты связывания с доступными ШИМ (например, PySite).
- В качестве меченой референсной ДНК закажите олигомеры, которые флуоресцентно помечены либо на прямой, либо на обратной цепи на 3' или 5' конце. Используйте, например, Cy5, Bodipy-650 или любой другой подходящий краситель в концентрации 10 мкМ (100 мкМ 10x стоковый) в воде и разбавляйте ступенчато, как описано в шаге 3.1.
- Приготовьте 500 мл 1x связывающего буфера, добавив 33 мМ буфера фосфата калия (pH = 7,0), 90 мМ NaCl и 0,01% неионогенного детергента в дистиллированную воду. Также приготовьте 3-кратный связывающий буфер, который содержит те же компоненты, только в трехкратных концентрациях. При использовании буфера для связывания 3x в качестве стокового раствора для буфера для связывания 1x подготовьте объемы > 500 мл; в противном случае готовят 250 мл.<бр/>
заметка: Эта композиция была оптимизирована для обеспечения стабильности транскрипционного фактора и предотвращения димеризации глутатион-S-трансферазы (GST).
- Измерьте с помощью микроскопической установки, описанной на шаге 1, FA 200 мкл связывающего буфера, содержащего 0,8 нМ меченую референсную ДНК, в присутствии различных количеств TF в 96-луночном планшете для микроскопии со стеклянным дном (5-6 лунок с различными концентрациями TF) для определения используемой концентрации TF. Провести серию титрования с возрастающими значениями TF и выбрать для анализа концентрацию, для которой кривая достигает плато, указывающего на полное связывание референсного олигомера ДНК.
заметка: Оптимальная концентрация ТФ зависит от значений констант диссоциации ТФ-ДНК. Как правило, для более низких концентраций KDтребуются более низкие концентрации.
3. Отжиг олигомеров
- Для отжига олигомеров ДНК меченой референсной ДНК (последовательность, определенная на предыдущем этапе) смешайте 7 мкл 10 мкМ меченного красителем одноцепочечного раствора ДНК и 7 мкл 10 мМ концентрации его немеченого обратного комплемента в 186 мкл воды.
- Для последовательностей ДНК конкурентов смешать 20 мкл 100 мМ растворов (в воде, предоставленной производителем) прямой одноцепочечной ДНК с 20 мкл 100 мМ соответствующей обратной одноцепочечной ДНК для каждой отдельной измеряемой последовательности конкурента.
- Отжиг выполняют отдельно в стандартном амплификаторе для ПЦР, нагревая растворы до 70 °C в течение 3 мин и снижая температуру до RT со скоростью 0,1 K/s. Если используемая ПЦР-машина не поддерживает температурные градиенты с такой скоростью, просто проведите ступенчатую инкубацию с понижением температуры (было протестировано 99 циклов по 3 с -0,4 К за цикл).
4. Приготовление геля
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий раздел объясняет приготовление двух различных типов гелей: 1) лунки для титрования содержат гели с белком и используются для определения KDдля соответствующих последовательностей ДНК конкурентов, и 2) калибровочные лунки используют NB для определения концентрации ДНК в каждый данный момент времени и на высоте сбора. Основное внимание уделяется подготовке эксперимента в 96-луночном планшете, но также указаны соответствующие объемы для 384-луночного планшета.
- Растворите 0,5% мас./v агарозы с низкой температурой плавления в связующем буфере, сварив его в лабораторной микроволновой печи. После полного растворения снова отрегулируйте объем с помощью ddH2O, чтобы компенсировать возможное испарение.
заметка: Для удобства приготовьте запас из 10-20 10 мл аликвот гелей и растопите их при температуре 75°C, когда они понадобятся. Запасы геля можно хранить по адресу RT.
осторожность: Будьте осторожны, чтобы не допустить перегрева гелевого раствора в микроволновой печи. Предпочтительны короткие временные интервалы нагрева с встряхиванием между ними.
- Для подготовки титрованных и калибровочных лунок сначала расплавьте две 10 мл гелевого запаса при температуре 75 °C при встряхивании.
- Используйте 240 μL (включая 20% накладных расходов) для каждого конкурента (n = количество последовательностей конкурентов).
- Используйте один и тот же объем геля для калибровочной лунки NB, чтобы обеспечить одинаковую температуру и вязкость обоих гелей.
- Затем установите температуру на 35 °C и дождитесь выравнивания температуры.
- Для титрующих лунок добавляют 1,4 нМ (конечная концентрация), гибридизованную референсную ДНК (полученную на стадии 3), белок TF (конечная концентрация CTF = 20-60 нМ, как определено на стадии 2.6), DTT (0,2 мМ) и связывающий буфер в общем объеме n x 200 μL или n x 13 μL в формате 96- или 384-луночных планшетов, соответственно (плюс накладные расходы). Тщательно перемешайте, переворачивая/встряхивая (не завихривая).
- Медленно добавляйте 200 мкл на лунку в формате 96-луночного планшета (13 мкл/лунка для 386 лунок) гелеобразного раствора, приготовленного на предыдущем этапе, в титруемые лунки луночного планшета.
- Для калибровочных лунок сначала добавьте 5 нМ NB в расплавленный гель снаружи лунок (общий объем зависит от используемого формата луночной пластины и от количества калибровочных лунок; обычно достаточно 5-6 на луночную пластину).
Медленно вводите - пипетку объемом 200 μл (13 μл для 384-луночного планшета) NB-содержащий гель в титрорационные лунки луночного планшета, стараясь не допускать образования пузырьков воздуха.
заметка: Использование электронных пипеток или робототехники значительно повышает воспроизводимость.
- Дайте гелю застыть в течение 10 минут при RT, а затем еще 10 минут при 4 °C (после этого удалите конденсат со стекла, если это необходимо). Убедитесь, что все эти шаги выполнены на идеально горизонтальной поверхности, чтобы избежать неоднородных гелевых поверхностей.
заметка: Белоксодержащие гели обычно стабильны в течение как минимум нескольких часов при 4 °C.
5. Добавление решения для ДНК конкурентов
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие растворы должны быть подготовлены перед началом титрования и добавлены поверх калибровочных и титрорационных лунок одновременно.
- Добавьте отожженную меченую референсную ДНК и белок в 3-кратный связывающий буфер в концентрациях, в 3 раза превышающих аликвоты гелевого материала.
- Смешайте 20 мкл полученного раствора с 40 мкл каждого отожженного раствора ДНК конкурента, полученного на стадии 3.
- Для каждой калибровочной лунки смешайте 20 мкл 3x связывающего буфера, содержащего 15 мМ раствор NB, с 40 мкл отожженной ДНК конкурента (подойдет любая последовательность той же длины).
заметка: Для 384-луночных планшетов используйте 21 мкл вместо 60 мкл в целом.
- При необходимости проверьте однородность уровней высоты геля в различных лунках планшета спектроскопическим способом, измерив абсорбцию на длине волны 380 нм с помощью считывателя многолуночных планшетов (значения абсорбции пропорциональны высоте геля).
- Добавьте 50 μL (7 μL для формата 384-луночного планшета) смешанных растворов ДНК конкурентов (отожженных на этапе 3) поверх гелей. Постарайтесь добавить все решения конкурентов как можно быстрее, используя электронные многоканальные пипетки или 96-канальную пипетирующую головку, если таковая имеется. После добавления решений конкурентов поместите пластину на предметный столик микроскопа и сразу же приступайте к измерениям.
6. Получение изображений
- Последовательно получайте временные ряды z-стеков (например, используйте 12 плоскостей и 100-300 мс времени освещения). Избегайте получения изображений слишком близко к поверхности скважины (< ~1,4 мкм с использованием пластин, используемых в данном документе), чтобы исключить любое смещение поляризации.
- Выполните 10-25 циклов измерений до полного отвязки меченой референсной ДНК от ТФ. Конечная точка обычно достигается через 1-2 ч, в зависимости от кинетики связывания и диффузии конкурирующей ДНК
.
