1. Подготовка системы
- Дизайн плазмид связывающего сайта
- Спроектируйте кассету с сайтом привязки, как показано на рисунке Рисунок 1. Каждый миниген содержит следующие части (от 5' до 3'): сайт рестрикции eagl, ∼40 оснований 5'-конца гена резистентности к канамицину (Kan), промотор pLac-Ara, сайт связывания рибосом (RBS), AUG гена mCherry, спейсер (δ), сайт связывания RBP, 80 оснований 5'-конца гена mCherry, и сайт ограничения ApaLI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы повысить вероятность успеха анализа, разработайте три кассеты для сайта связывания для каждого сайта связывания, с спейсерами, состоящими, по крайней мере, из одного, двух и трех оснований. Дополнительные рекомендации см. в разделе «Репрезентативные результаты».
- Клонирование плазмид сайтов связывания
- Закажите кассеты сайта связывания в виде двухцепочечных минигенов ДНК (дцДНК). Каждый миниген имеет длину ∼500 п.о. и содержит сайт рестрикции Eagl и сайт рестрикции ApaLI на концах 5' и 3' соответственно (см. шаг 1.1.1).
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте мини-гены с половиной гена канамицина были упорядочены, чтобы облегчить скрининг на положительные колонии. Тем не менее, здесь также подходит сборка Гибсона, и в этом случае сайт связывания может быть упорядочен в виде двух более коротких комплементарных одноцепочечных олигон ДНК.
- Дважды переварите как мини-гены, так и вектор-мишень с помощью Eagl-HF и ApaLI по протоколу рестрикции, а затем очистите колонку.
- Лигируйте расщепленные минигены в костяк сайта связывания, содержащий остальную часть репортерного гена mCherry, терминатор и ген резистентности к канамицину.
- Трансформируйте раствор лигирования в Escherichia coli ТОП10 клеток.
- Идентификация положительных трансформантов с помощью секвенирования по Сэнгеру.
- Спроектируйте праймер на 100 базах вверх по течению до интересующей области (см. Таблицу 1 для последовательностей праймеров).
- Подготовьте несколько колоний бактерий.
- Приготовьте 5 мкл 5 мкл раствора праймера и 10 мкл ДНК в концентрации 80 нг/мкл.
- Отправьте два решения в удобный центр для секвенирования по Сэнгеру.
- Храните очищенные плазмиды при температуре -20 °C, а штаммы бактерий в виде запасов глицерина, оба в формате 96 лунок. Затем ДНК будет использована для трансформации в E. coli TOP10 клеток, содержащих одну из четырех плазмид слияния-RBP (см. шаг 1.3.5).
- Проектирование и конструирование плазмиды RBP
ПРИМЕЧАНИЕ: Аминокислотные и нуклеотидные последовательности белков оболочки, использованных в этом исследовании, перечислены в таблице Таблица 2.
- Закажите требуемую последовательность RBP без стоп-кодона в виде специально заказанного минигена дцДНК без стоп-кодона с сайтами рестрикции на концах (Рисунок 1).
- Клонируйте испытуемый RBP, лишенный стоп-кодона, непосредственно после индуцируемого промотора и перед флуоресцентным белком, лишенным стартового кодона (Рисунок 1), аналогично шагам 1.2.2-1.2.4. Убедитесь, что плазмида RBP содержит ген устойчивости к антибиотикам, отличный от гена плазмиды с сайтом связывания.
- Идентификация положительных трансформантов с помощью секвенирования по Сэнгеру, аналогично шагу 1.2.5 (см. Таблица 1 для последовательностей праймеров).
- Выберите один положительный трансформатор и сделайте его химически грамотным. Хранить в виде очищенных от глицерина плазмид при -20 °С и запасы глицерина штаммов бактерий при -80 °С в 96-луночных планшетах.
- Трансформируйте плазмиды с сайтом связывания (из шага 1.2.6), хранящиеся в 96-луночных планшетах, в химически компетентные бактериальные клетки, уже содержащие RBP-mCerulean плазмиду. Чтобы сэкономить время, вместо того, чтобы помещать клетки на чашки Петри, наложите их с помощью 8-канального пипеттора на 8-полосные планшеты, содержащие агар Лурии-Бертани (LB) с соответствующими антибиотиками (Kan и Amp). Колонии должны появиться через 16 ч.
- Выберите одну колонию для каждого двойного трансформанта и выращивайте в течение ночи в среде LB с соответствующими антибиотиками (Kan и Amp) и храните в виде запасов глицерина при -80 °C в 96-луночных планшетах.
2. Настройка эксперимента
ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный здесь протокол был выполнен с использованием роботизированной системы для работы с жидкостями в сочетании с инкубатором и считывателем планшетов. Каждое измерение проводилось для 24 концентраций индуктора, с двумя дубликатами для каждой комбинации штамм + индуктор. С помощью этой роботизированной системы были собраны данные по 16 штаммам в сутки с концентрациями 24 индукторов. Однако, если такое устройство недоступно или если требуется меньшее количество экспериментов, их можно легко сделать вручную с помощью 8-канальной многоканальной пипетки и соответствующим образом адаптировать протокол. Например, таким образом были получены предварительные результаты для четырех штаммов в день с 12 концентрациями индукторов и четырьмя временными точками.
- Заранее приготовьте 1 л буфера для биопроб (BA), смешав 0,5 г триптона, 0,3 мл глицерина, 5,8 г NaCl, 50 мл 1 M MgSO4, 1 мл 10-кратного буфера с фосфатно-солевым буфером (PBS) pH 7,4 и 950 мл двойной дистиллированной воды (DDW). Автоклавная или стерильная фильтрация буфера БА.
- Штаммы с двойным трансформантом выращивают при 37 °C и 250 об/мин, встряхивая в 1,5 мл ЛЛ с соответствующими антибиотиками (канамицин в конечной концентрации 25 мкг/мл и ампициллин в конечной концентрации 100 мкг/мл) в 48-луночных планшетах в течение 18 ч (на ночь).
- Утром сделайте следующие приготовления.
- Индукторная пластина. В чистом планшете на 96 лунок подготовить лунки с полубедной средой (СЗМ), состоящей на 95% БА и 5% LB26 в инкубаторе при температуре 37 °С. Количество лунок соответствует желаемому количеству концентраций индукторов. Добавьте C4-HSL в лунки в пластине индуктора, которые будут содержать самую высокую концентрацию индуктора (218 нМ).
- Запрограммируйте робота на последовательное разбавление среды из каждой лунки с самой высокой концентрацией до 23 более низких концентраций в диапазоне от 0 до 218 нМ. Объем каждого разведения индуктора должен быть достаточным для всех штаммов (включая дубликаты).
- Во время приготовления индукторов нагрейте 180 мкл СЗМ в инкубаторе при температуре 37 °С, в 96-луночных планшетах.
- Разбавляют ночные штаммы с шага 2.2 в 100 раз путем последовательных разведений: сначала разбавляют в 10 раз, смешивая 100 мкл бактерий с 900 мкл СЗМ в 48-луночных планшетах, а затем снова разбавляют в 10 раз, взбирая 20 мкл из разбавленного раствора в 180 мкл предварительно подогретого СЗМ, в 96-луночных планшетах подходят для флуоресцентных измерений.
- Добавьте разбавленный индуктор из индукторной пластины в 96-луночные планшеты с разбавленными штаммами в соответствии с конечными концентрациями.
- Встряхивайте 96-луночные планшеты при температуре 37 °C в течение 6 часов, одновременно измеряя оптическую плотность при флуоресценции 595 нм (OD595), mCherry (560 нм/612 нм) и mCerulean (460 нм/510 нм) с помощью считывателя планшетов каждые 30 минут. В целях нормализации измерьте рост SMP без добавления клеток.
