1. День 9 (утро): Начните бактериологическое исследование для ферментативного измерения.
- Повторно суспендируйте культуру и перенесите 125 мкл с помощью многоканальной пипетки на пластину спектрофотометра (внешний диаметр600).
заметка: Внимание: Не выдавайте последнюю каплю, чтобы избежать образования пузырьков, если наружный диаметр600 ниже 0,3 - 0,6, инкубируйте оставшиеся клетки еще 1 - 2 часа в зависимости от показаний. Культура объемом 125 μл, используемая на этом этапе, может быть отброшена или перенесена обратно в исходный блок глубокой скважины по усмотрению пользователя.
- Центрифугируйте оставшиеся ячейки в блоке глубокого колодца в течение 10 мин при 3000 x g и 21 °C. Удалите надосадочную жидкость путем инвертирования.
- Добавьте 200 μL Z-буфера и vortex.
заметка: Пожалуйста, ознакомьтесь с рецептом Z-буфера в таблице 1.
- Центрифугируйте в течение 5 мин при 3000 x g и 21 °C. Удалите надосадочную жидкость путем инвертирования.
- Добавьте 20 мкл Z-буфера и вортекс.
- Накройте пластину герметизирующей пленкой, которая может противостоять циклам замерзания-оттаивания. Выполните 4 цикла замораживания/размораживания с использованием жидкого азота в вытяжном шкафу, а затем при температуре 42 ºC на водяной бане (по 2 минуты каждый).
- Добавьте 200 мкл Z-буфера/бета-меркаптоэтанола (β-ME)/орто-нитрофенил-β-галактозида (ONPG) (12 мл, 21 мкл, 8,4 мг соответственно, чтобы получить 20 мл раствора; всегда готовьте свежий).
заметка: ONPG потребуется некоторое время, чтобы правильно раствориться, поэтому приготовьте раствор за час до этого этапа. ONPG служит субстратом для измерения активности β-галактозидазы.
- Инкубируйте до 17 - 24 часов при 30 °C (проверьте между ними, если цвет развивается раньше, переходите к следующему этапу).
2. День 10 (утро): Остановите реакцию и измерьте.
- Добавьте 110 μL 1M Na2CO3, чтобы остановить реакцию и записать время.
- Вортекс и центрифуга в течение 10 мин при 3000 x g и 21 °C.
- Возьмите 125 мкл надосадочной жидкости с помощью многоканального и измерьте внешний диаметр420,<бр/>
заметка: Внимание, не выдавайте последнюю каплю, чтобы избежать образования пузырьков.
Таблица 1: Рецептура растворов, используемых в протоколе. Таблица содержит рецептуру исходных и рабочих растворов основных буферов, используемых в анализе.
| TE буфер 10X (10мл) | |
| желательный | Со склада |
| 1000 мМ Tris-Cl (pH 8,0) | 1 мл Tris 1M |
| 10 мМ ЭДТА (pH 8,0) | 200 мкл ЭДТА 0,5 м |
| Восполните объем водой | |
| TE/LiAc (10 мл) | |
| желательный | Со склада |
| В 1 раз | 1 мл TE 10X |
| 0,1 млн LiAc | 1 мл LiAc 1 М |
| Восполните объем водой | |
| TE/LiAc/PEG (50 мл) 50% | |
| желательный | Со склада |
| В 1 раз | 5 мл TE 10X |
| 0,1 млн LiAc | 5 мл LiAc 1М |
| 40 мл PEG3350 | |
| Z-буфер (1 л) pH 7,0 | |
| Na2HPO4 16,1 г гептагидрата или 8,52 г безводного |
| 2PO4 5,5 г гидратированного или 4 г безводного |
| KCl 0.75g |
| MgSO4 0,246г гидратированного или 0,12г безводного |
| Поддерживайте pH с помощью HCl |
| Все растворы стерилизуются перед использованием. |
| Медиа и агаровые пластины, используемые в протоколе (YPDA, SD-Ura; агаровые пластины SD-Trp-Ura и SD-Trp-Ura) следуют тому же рецепту, что и в Y1H |
