Измерение активности геликазы белка-мишени с помощью меченых биотином дуплексов РНК

Аннотация

Источник: Yu, L. et al., Биохимические анализы in vitro с использованием меток биотина для изучения белково-нуклеиновых взаимодействий. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы демонстрируем процедуру определения геликазной активности белка-мишени для раскручивания субстрата дцРНК, меченного биотином. Активность фермента была идентифицирована путем анализа электрофоретического сдвига подвижности с последующим хемилюминесцентным анализом с использованием хемилюминесцентного фермента-конъюгированного стрептавидина.

Протокол

1. Приготовление белка

1. Конструкции выражений MOV10
   1. Генерация конструкций экспрессии кДНК, кодирующих мышь MOV10.
      1. Настройте реакции полимеразной цепной реакции (ПЦР) для каждого фрагмента. Смешайте 1 мкл мышиной кДНК (из C57BL/6 мышиного яичка), 1 мкл dNTP, 2 мкл 10 мкМ прямого праймера, 2 мкл 10 мкМ обратного праймера, 1 мкл ДНК-полимеразы, 25 мкл 2x ПЦР-буфера и 18 мкл дважды дистиллированного H₂O (ddH₂O) в конечном объеме 50 мкл.
         заметка: Праймеры для амплификации фрагментов гена Mov10 перечислены в таблице 1.
      2. Проводят ПЦР-реакции по следующим программам: 95 °C в течение 5 мин, 35 циклов нагрева при 95 °C в течение 15 с, отжиг при 64 °C в течение 15 с, удлинение при 72 °C в течение 20 с (2 мин для удлинения MOV10 по всей длине) и окончательное удлинение при 68 °C в течение 7 мин.
   2. Проанализируйте амплифицированную ПЦР-ДНК методом гель-электрофореза, быстро вырежьте из геля полосу нужного размера под УФ-лампой и поместите ее в центрифужную пробирку.
      заметка: Ожидаемый размер продукта, видимый на агарозном геле для MOV10, составляет 3015.н.
   3. Очистите ДНК ПЦР с помощью набора для экстракции геля, следуя протоколу производителя.
      1. Добавьте равный объем растворяющего буфера в центрифужную пробирку из шага 1.1.2 и растопите гель на водяной бане при температуре 50-55 °C в течение 5-10 минут, убедившись, что кусочки геля полностью растают. Кратковременно центрифугой, чтобы собрать любые капли со стенки пробирки.
         заметка: Масса/объемная концентрация геля и растворимого буфера составляет 1 мг/мкл.
      2. Поместите адсорбционную колонку в сборную пробирку, перенесите раствор, содержащий растворенный фрагмент геля, в адсорбционную колонну и центрифугируйте при 12 000 x g в течение 2 минут.
      3. Выбросьте фильтрат на дно пробирок для сбора. Добавьте 600 μл промывочного буфера в колонку, центрифугируйте при 12 000 x g в течение 1 минуты и выбросьте фильтрат.
      4. Повторите шаг 1.1.3.3 один раз.
      5. Поместите колонку обратно в сборную трубку и центрифугируйте при давлении 12 000 x g в течение 2 минут, чтобы удалить весь оставшийся буфер промывки.
      6. Поместите адсорбционную колонку в стерилизованную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, добавьте 50 мкл ddH₂O в центр адсорбционной колонки и центрифугируйте при давлении 12 000 x g в течение 1 мин. Измерьте концентрацию ДНК элюата с помощью спектрофотометра.
   4. Рестрикционное переваривание плазмид
      1. Расщепляют вектор pRK5 с BamHI и XhoI путем смешивания 4 г вектора pRK5, 5 мл 10-кратного буфера для расщепления, 1 мкл BamHI и 1 мкл XhoI и ddH₂O до конечного объема реакции 50 мкл. Инкубируют при 37 °C в течение 2 ч.
   5. Проанализируйте векторную ДНК методом гель-электрофореза, быстро вырежьте из геля полосу нужного размера скальпелем под УФ-лампой и поместите ее в центрифужную трубку.
   6. Очистите векторную ДНК с помощью набора для экстракции геля по версии 1.1.3, следуя инструкциям производителя.
   7. Организовать стандартную реакцию рекомбинантного лигирования путем объединения 0,03 пмоль линеаризованного вектора, 0,06 пмоль фрагмента кДНК, 2 мкл лигазы и 4 мкл 5-кратного лигазного буфера и ddH₂O в конечном реакционном объеме 10 мкл<бр/> заметка: Клонируем MOV10 в вектор pRK5.
   8. Инкубируйте смесь при температуре 37 °C в течение 30 минут, а затем сразу охладите реакцию в течение 5 минут на льду. Преобразование рекомбинантных плазмид MOV10 в бактерии DH5α.
      заметка: Проверьте все рекомбинантные конструкции с помощью секвенирования по Сэнгеру.
   9. Готовят запасы глицерина бактериальных культур, содержащих проверенные рекомбинантные плазмиды, добавляя равный объем 50% глицерина к жидким культурам и храня при -80 °С. <бр/> заметка: Для каждого последующего эксперимента выносите бактерии из запасов глицерина на свежую агаровую пластину и используйте одну колонию для расширения, как описано на шаге 1.2.
2. Экстракты белка MOV10 из HEK293T клеток
   1. Транзиторно экспрессируют белки MOV10 в культивируемых HEK293T клетках.
      1. Готовят плазмиду MOV10-pRK5 в концентрации >500 нг/мкл.
      2. Семена HEK293T ячейки в посуду по 15 см. Когда плотность клеток достигнет ~70%-90%, замените среду для культивирования клеток свежей модифицированной средой Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина.
      3. Для одной трансфекции разведите 60 мкг плазмидной ДНК MOV10-pRK5 в 3 мл восстановленной сывороточной среды, затем добавьте 120 мкл реагента-усилителя трансфекции и хорошо перемешайте.
      4. В отдельной пробирке разведите 90 мкл реагента для трансфекции с 3 мл восстановленной сывороточной среды (без пенициллин-стрептомицина) и хорошо перемешайте.
      5. Добавьте разведенную ДНК в каждую пробирку с разведенным реагентом для трансфекции. Выдерживать при комнатной температуре в течение 15 минут.
      6. Добавьте трансфекционную смесь к клеточной культуре и культивируйте клетки в течение ~36-48 ч.
   2. Через 36-48 ч соберите клетки с каждой пластины в пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C. Промойте каждую гранулу 10 мл ледяного PBS и соберите клетки центрифугированием при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C.
   3. Ресуспендируйте гранулу в 3 мл буфера для лизиса клеток, содержащего полный коктейль ингибиторов протеазы, не содержащий этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Выдерживать 30 минут на льду. Центрифугируйте лизат при 20 000 x g и 4 °C в течение 20 минут.
   4. Добавьте 100 мкл магнитных шариков anti-FLAG на чашку клеток в пробирке объемом 1,5 мл.
   5. Промойте магнитные шарики 2 раза буфером K150 (50 мМ HEPES при pH 7,5, 150 мМ KoAc, 1 мМ DTT, 0,1% NP-40).
      1. Ресуспендируйте магнитные шарики в 1 мл ледяного буфера K150.
      2. Инкубируйте магнитные шарики в течение 2 минут при температуре 4 °C при осторожном вращении и гранулируйте магнитные шарики с помощью магнита. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
   6. Добавьте магнитные шарики в надосадочную жидкость клеточного лизата из шага 1.3.3 и инкубируйте при 4 °C в течение 2 ч.
   7. Промойте связанные с белком магнитные шарики 3 раза буфером K150, затем 2 раза K150, содержащим 250 мМ NaCl, затем 3 раза буфером K150 как 1.3.5.
   8. Ресуспендируйте шарики в 300 μл элюирующего буфера FLAG (100 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl при pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 10% глицерина), добавьте пептид FLAG до конечной концентрации 0,5 μг/μл и инкубируйте с шариками на ротаторе при 4 °C в течение 1 ч, затем гранулируйте магнитные шарики с помощью магнита.
   9. Соберите надосадочную жидкость, содержащую элюированные белки MOV10, определите концентрацию и храните при температуре -80 °C для дальнейшего использования.

2. Получение нуклеиновых кислот

1. Приобретайте олигонуклеотиды ДНК и РНК (олигонуклеотиды) с метками биотина или без них из подходящего источника. Разбавьте каждый олиго в не содержащем РНКазы ddH от₂O до 20 мкМ и сохраните его при -80 °C для дальнейшего использования.
   заметка: Олигопоследовательности субстратов ДНК/РНК, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 2.
2. Приготовьте следующую смесь для реакции отжига двухцепочечной РНК (дцРНК) для анализа активности геликаз MOV10: смешайте 60 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазина-N-этан-сульфоновую кислоту (HEPES) при pH 7,5, 6 мМ KCl, 0,2 мМ MgCl2 и РНКазу ddH₂O в конечном реакционном объеме 20 мкл.
3. Отожжение олигопластов РНК с образованием дуплекса РНК путем нагревания смеси меченой биотином верхней цепи (2 мкМ, конечная концентрация) и в 1,5 раза ее немеченой комплементарной нижней цепи в буфере для отжига (шаг 2.2) при 95 °C в течение 5 мин, а затем медленное охлаждение до комнатной температуры (RT).

3. Биохимические анализы in vitro

1. EMSA и ферментативные реакции
   1. Для анализа активности геликазы MOV10 смешайте 50 мМ Tris-HCl при pH 7,5, 20 мМ KoAc, 2 мМ MgCl₂, 0,01% NP-40, 1 мМ DTT, 2 Ед/мкл ингибитора РНКазы, 10 нМ биотин-меченого субстрата РНК, 2 мМ аденозинтрифосфата (АТФ), 100 нМ ловушки РНК и 20 нг белка MOV10 и ddH₂O в конечном реакционном объеме 20 мкл. Инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 10 мин, 30 мин и 60 мин. Добавьте 5-кратный буфер остановки для остановки реакции.
      заметка: РНК-ловушка, немеченый биотином олиго с последовательностью, комплементарность меченому олиго, которая предотвращает повторный отжиг размотанной дцРНК.
2. Полиакриламидные гели
   1. Вымойте гелевые пластины (16 см х 16 см) и расчески 1,5 мм. Соберите блоки для гель-электрофореза.
   2. Чтобы приготовить 10% нативный полиакриламидный гель, смешайте 14 мл ddH₂O, 1,25 мл 10x трисборной кислоты-ЭДТА (TBE), 8,3 мл 30% акриламида, 1,25 мл 50% глицерина, 187,5 мкл 10% свежеприготовленного персульфата аммония (APS) и 12,5 мкл тетраметилэтилендиамина (TEMED).
   3. Чтобы приготовить 20% нативный полиакриламидный гель, смешайте 5,5 мл ddH₂O, 1,25 мл 10x TBE, 1,25 мл 50% глицерина, 16,7 мл 30% акриламида, 187,5 мкл 10% APS и 12,5 мкл TEMED.
   4. Влейте раствор акриламида сразу в гель и вставьте расческу. Дайте смеси полимеризоваться в течение примерно 30 минут.
3. Гелевый бег
   1. Снимите расческу и заполните баки буфером для электрофореза (0,5x TBE).
   2. Промойте лунки для образцов 0,5x TBE буфером, затем предварительно запустите гель при 100 В на льду в течение 30 мин. Замените работающий буфер свежим 0,5x TBE.
   3. Загрузите в каждую лунку по 20-25 мкл образцов.
   4. Используйте 10% нативный акриламидный гель для анализа EMSA и 20% нативный акриламидный гель для ферментативных анализов. Запустите электрофорез при напряжении 100 В на ледяной бане до тех пор, пока бромфенольный синий маркер не мигрирует в нижнюю четверть геля.
4. Разберите гелевые пластины и обрежьте гель, удалив загрузочные колодцы и неиспользуемые дорожки. Поместите гель в буфер 0,5x TBE.
5. Отрежьте фильтровальную бумагу и капроновую мембрану по размеру геля. Предварительно намочите чистую фильтровальную бумагу и нейлоновую мембрану.
6. Соберите стек для переноса.
   1. Поместите предварительно смоченную мембрану на предварительно смоченную фильтровальную бумагу.
   2. Поместите гель на мембрану.
   3. Накройте гель еще одним слоем предварительно влажной фильтровальной бумаги.
   4. Удалите все пузырьки воздуха, прокатав чистой пипеткой от центра к краю.
7. Перенесите образцы из геля на мембрану в полусухом электрофоретическом аппарате при давлении 90 мА в течение 20 мин.
8. Остановите перенос, а затем высушите мембрану на новой фильтровальной бумаге в течение 1 минуты.
9. Сшивайте образцы путем облучения мембраны со скоростью 120 мДж/^см2 в течение 45-60 с в сшивающем агенте ультрафиолетового излучения, оснащенном лампами с длиной волны 254 нм (функция автоматического сшивания). Просушите мембрану на воздухе при температуре RT в течение 30 минут.
10. Обнаружение хемилюминесценции
    1. Протокол 1: Используйте стандартный объем коммерческого набора для обнаружения хемилюминесцентных нуклеиновых кислот.
       1. Добавьте в мембрану 20 мл блокирующего буфера и инкубируйте в течение 15-30 минут с легким встряхиванием на ротаторе при 20-25 оборотах в минуту.
       2. Приготовьте конъюгатный/блокирующий буферный раствор путем добавления 66,7 мкл стабилизированного конъюгата стрептавидин-хренпероксидазы к 20 мл блокирующего буфера.
       3. Аккуратно снимите блокирующий буфер и замените его сопряженным/блокирующим буфером. Инкубировать в течение 15 мин на ротаторе при 20-25 оборотах в минуту.
       4. Промыть мембрану 4 раза с встряхиванием при 40-45 об/мин в течение 5 мин каждая.
       5. Добавьте в мембрану 30 мл буфера для уравновешивания субстрата. Инкубировать мембрану в течение 5 мин с встряхиванием при 20-25 оборотах в минуту.
       6. Приготовьте рабочий раствор субстрата, добавив 6 мл раствора люминола/усилителя к 6 мл стабильного раствора перекиси. Избегайте света.
       7. Покрыть всю поверхность мембраны рабочим раствором субстрата и выдерживать 5 мин.
       8. Сканируйте мембрану в хемилюминесцентной системе визуализации в течение 1-3 с.

Таблица 1: Праймеры, используемые для амплификации фрагментов генов Meiob и Mov10.Жирными буквами в прямых и обратных грунтовках обозначены места резки BamHI и NotI; курсивные жирные буквы в обратной грунтовке — это места резки XhoI; жирными буквами в квадратах обозначены нуклеотиды, соответствующие точечной мутации R235A.

Фрагменты	Грунтовки	Последовательности (от 5' до 3')
MEIOB-A	вперёд	CGGGATCCATGTTACTTTTTTTGATACACTTGCC
	обратный	ВGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-C	вперёд	CCGCGTGGATCCATGGAACCAAAATACTTTACAACTTCA
	обратный	CGATGCGGCCGCCTCTTTATTTTCTTATATAATTCAGTAG
MEIOB-E	вперёд	CCGCGTGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
	обратный	CGATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-E-mut	вперёд	CTCTGATGTGGCAATAAATTTTAAC
	обратный	GTTAAAATTTATTGCCACATCAGAG
MOV10	вперёд	GACGACGATGACAAGGGATCCATGCCTAGCAAGTTCAGCTGCC
	обратный	GCTTACTCAGCTAAGCTCGAGTCAGAGCTCATTTCTCCACTCTG

Таблица 2: Последовательности субстратов ДНК/РНК, использованных в данной работе.

5'-биотин-GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU-3

Для цифр	Имена	Последовательности (от 5' до 3')
Рисунок 2, 5	36 нт ссДНК	5'-Биотин-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3' (ДНК)
Рисунок 3	36 нт ссРНК	' (РНК)
Рисунок 4	54 nt 5'-хвостатая дцРНК	5'-Биотин-ACCGCUGCCGUCGCUCCG-3' (РНК) 5'-ACGAGGGAGACGAGGAGAGGGCGACGGCAGCGGGU-3'(РНК)

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
оборудование
центрифуга	Эппендорф, Германия	5242Р
Система хемилюминесцентной визуализации	Танон, Китай	5200
Цифровой сонифер	Брэнсон, США	BBV12081048A	450 Вт; 50/60 Гц
Полусухая электрофоретическая промокашка	Hoefer, США	ТЭ77ХР
Трубчатый револьвер	Crystal, США	3406051
Сшивающий агент с ультрафиолетовым излучением	UVP, США	КЛ-1000
материалы
Нейлоновая мембрана	Thermo Scientific, США	TG263940A
Чашка для культур, обработанная TC	Corning, США	430167	100 мм
Чашка для культур, обработанная TC	Corning, США	430597	150 мм
Микротрубки пробирки	AXYGEN, США	MCT-150-C	1,5 мл
Трубы	Corning, США	430791	15 мл
Реагентов
Магнитные бусины Anti-FLAG M2	Sigma, США	М8823
СПС	Thermo Scientific, США	591136
BCIP/NBT Набор для разработки красителя щелочной фосфатазы	Beyotime, Китай	С3206
Реагент для лизиса CelLyticTM M Cell	Sigma, США	107М4071В
Одношаговый набор для клонирования ClonExpress II	Вазиме, Китай	С112
Набор для обнаружения хемилюминесцентных нуклеиновых кислот	Thermo Scientific, США	T1269950
dNTP	Сигма-Олдрич, США	DNTP100-1КТ
DMEM	Gibco, США	10569044
Эдта	Invitrogen, США	AM9260G	0,5 млн
Коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА	Roche, США	4693132001
Набор плазмид EndoFree Maxi	Вазиме, Китай	ДК202
Мини-набор для экстракции ДНК в геле FastPure	Вазиме, Китай	ДК301-01
ФБС	Gibco, США	10437028
Пептид FLAG	Sigma, США	Ф4799
глицерин	Sigma, США	SHBK3676
Буфер HEPES	Sigma, США	SLBZ2837	1 М
КОАк	Сангон Биотех, Китай	127-08-02
MgCl2	Invitrogen, США	AM9530G	1 М
NaCl	Invitrogen, США	АМ9759	5 МИН.
НП-40	Амреско, США	М158-500МЛ
Opti-MEM средний	Gibco, США	31985062
ПБС	Gibco, США	10010023	рН 7,4
Ингибитор РНКазы	Promega, США	Н251Б
Стрептавидин щелочная фосфатаза	Promega, США	В5591
КЭ	Invitrogen, США	15581044
Буфер Tris-HCI	Invitrogen, США	15567027	1 м, pH 7,4
Буфер Tris-HCI	Invitrogen, США	15568025	1 м, pH 8.0
Подросток-20	Сангон Биотех, Китай	A600560