$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Ядерная экстракция и фиксация клеток
- Готовят исходные растворы: 0,2 М ТРУБКИ (рН 6,8), 5 М NaCl, 2 М сахароза, 1 М MgCl2, 0,1 М EGTA (рН 8,0).
- Приготовьте ядерный экстракционный буфер (NEB): растворите 10 мМ PIPES (pH 6,8), 100 mM NaCl, 300 mM сахарозы, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8,0) и 0,5% (v/v) Triton X-100 в ddH2O. Смешайте до полного растворения.
- Приготовьте 4% (v/v) параформальдегида (PFA): растворите 10 мл 16% водного раствора PFA в 30 мл PBS. Перемешайте до полного растворения.
- В подходящий момент времени (t=0, 1, 2, 4, 16 ч) дважды промойте ячейки 1 мл PBS. Полностью удалите PBS.
- Добавьте 200 μL NEB в каждую лунку для экстракции ядра клетки (цитоплазма разрушается, остается только ядро) (Рисунок 1). Инкубируйте в течение 2 минут при комнатной температуре и полностью удалите.
заметка: Не превышайте 2 минут.
- Промойте ячейки 1 мл PBS. Полностью удалите PBS. Добавляйте PBS осторожно, клетки на этом этапе очень хрупкие.
- Добавьте 200 мкл 4% (v/v) PFA в каждую лунку для фиксации клеток. Инкубировать в течение 10 минут при температуре 4 °C. Полностью удалить PFA.
- Добавьте 1 мл PBS.
заметка: Элементы могут храниться в PBS при температуре 4 °C.
2. Иммунофлуоресцентное окрашивание
- Приготовьте блокирующий раствор: растворите 5% BSA (v/v) в PBS и добавьте 0,3% (v/v) Triton X-100. Перемешайте до полного растворения.
- Приготовьте буфер для разбавления: растворите 1% BSA (w/v) в PBS и добавьте 0,3% (v/v) Triton X-100. Перемешайте до полного растворения.
- Для блокировки добавьте в каждую лунку по 200 мкл раствора для блокировки. Инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре или 16-18 часов при 4 °C.
заметка: Если будут использоваться козьи антитела, добавьте 5% козью сыворотку в блокирующий раствор.
- Развести первичное антитело в буфере для разведения (1:500; список антител см. в Таблице 1) и перемешать до равномерного перемешивания.
заметка: Если используются козьи антитела, добавьте 1% козью сыворотку в буфер для разведения.
- В коробку для влажности/инкубации приклейте кусок парапленки. Добавьте 10 мкл первичного антитела (в одной капле). Совместите один край покровного стекла с каплей и медленно опустите на парапленку, чтобы жидкость распространилась по всему стеклу (по возможности избегайте пузырьков). Выдерживать 2 часа при комнатной температуре.
- Постирайте покровные листы три раза в PBS в течение 1 минуты.
- Развести вторичное антитело в буфере для разведения (конечная концентрация: 2 мкг/мл) и сделать вихрем до хорошо перемешанного состояния.
- Внесите 10 мкл вторичного антитела, как описано для первичных антител. Выдерживать в течение 2 часов при комнатной температуре.
заметка: Беречь от света.
Таблица 1: Используемые антитела. Список антител, использованных в данном исследовании.
| антитело | компания | ссылка | источник |
| 53ВР1 | Клеточная сигнализация | 4937 | кролик |
| Антимышиный IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Абкам | АБ150103 | осел |
| Антифосфо-гистон H2A. X (Ser139), клон JBW301 | Многородность | 05-636 | мышь |
| Антикроличий IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Абкам | АБ150081 | коза |
- Постирайте покровные листы три раза в PBS в течение 1 минуты.
- Постирайте покровные стекла с помощью H2O в течение 1 минуты.
- Контрокрашивание ДНК с помощью DAPI: нанесите 10 мкл 300 нМ DAPI (как описано для антител), инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем установите на предметное стекло с помощью монтажной среды на основе глицерина. В качестве альтернативы добавьте одну каплю (10 μл) коммерческого монтажного носителя с защитой от выцветания, содержащего DAPI, на предметное стекло и наклейте покровное стекло. Аккуратно нажмите на покровную крышку и удалите лишнюю жидкость вокруг нее бумажным полотенцем.
- Заклейте покровные стекла прозрачным лаком для ногтей и дайте им высохнуть в течение 20 минут.
- Хранить предметные стекла при температуре 4 °C.
3. Получение изображений
- Нанесите каплю иммерсионного масла на объектив с 60-кратным увеличением. Используйте DAPI для определения местоположения ядер через окуляр.
- Для получения изображений XYZ откройте программное обеспечение для сбора данных и выберите параметры: Тип сканера: Galvano; Режим сканера: Roundtrip; Размер изображения: 512×512; Режим ФЭУ: ВПЗ; ФЭУ средняя: рамка (4 раза); Последовательное сканирование ФЭУ: линия.
- Выберите краситель и детекторы:
Канал (CH1), краситель (DAPI), детектор (SD1)
Канальный (CH2), Краситель (Alexa Fluor 488), Детектор (HSD3)
Канальный (CH3), Краситель (Alexa Fluor 647), Детектор (HSD4)
- Выберите ВКЛ в поле "Z".
- Настройте изображение в реальном времени. Нажмите кнопку «Трансляция» в окне «Трансляция».
- Отрегулируйте фокус и установите интенсивность лазера (%), чувствительность (HV), усиление и смещение в окне инструментов "PMT".
- Отрегулируйте интенсивность лазера (%): для яркости и обесцвечивания. Чем выше интенсивность лазера, тем сильнее сигнал, но образец будет фотообесцвечиваться.
- Отрегулируйте чувствительность (HV): уровень шума. Чем выше HV, тем сильнее сигнал, но изображение будет зашумленным, если оно слишком высокое.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда поддерживайте постоянное напряжение.
- Отрегулируйте смещение: уровень фона.
- Выберите «Начало/Конец» (15 срезов) для стеков Z.
- Начните приобретение.
- Выберите папку для сохранения изображений. Нажмите кнопку LSM Start, чтобы начать получение изображения. Нажмите кнопку «Серия готово», чтобы завершить получение изображения.
