Анализ вытягивания РНК-белка для выделения РНК-связывающих белков с помощью аффинной экстракции

Аннотация

Источник: Kresoja-Rakic, J., et al. Desthiobiotin-Streptavidin-affinity опосредованное очищение РНК-взаимодействующих белков в клетках мезотелиомы. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует анализ in vitro для идентификации РНК-связывающих белков (RBP), которые взаимодействуют с последовательностями элементов, богатых аденилат-уридилатами (ARE) в мРНК. RBP-мишени из клеточного лизата смешиваются с РНК-зондом с образованием комплексов РНК-белок. Комплексы выделяют с помощью аффинной очистки с использованием аффинности метки дестиобиотина РНК-зонда к магнитной бусине, меченной стрептавидином.

Протокол

1. Получение цитозольной и ядерной белковой фракции

1. Планшет 4 x 10⁶ клеток ACC-MESO-4 в колбе для клеточной культуры T150, выращенной в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 1x пенициллин/стрептомицин (100x) и 2 мМ L-глутамина (200 мМ). Когда клетки достигают конфлюенции 80-90% (~5-5,5 x 10⁶ клеток), приступают к экстракции белка ядерной и цитозольной фракций.
   заметка: Клеточная линия ACC-MESO-4 была получена из Биоресурсного центра RIKEN.
2. Отсадите среду, промойте клетки, добавив 15 мл 1x PBS, осторожно наклоните пластину несколько раз и аспирируйте 1x PBS. Добавьте 3 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируйте колбу с культурой при 37 °C в течение 3 мин.<бр/> заметка: Посмотрите на клетки под микроскопом на предмет отслойки; Если все еще прикреплено, постучите колбой по ладони 3 раза.
3. Добавьте 7 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 1x пенициллин/стрептомицин (100x) и 2 mM L-глутамина (200 мМ), соберите клетки в пробирку объемом 15 мл и уменьшите при 200 x g в течение 5 минут.
4. Аспирируйте среду и повторно суспендируйте клеточную гранулу 1,5 мл 1x PBS, затем перенесите клетки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Отжим при 500 x g и 4 °C в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
   заметка: Начиная с этого этапа, выполняйте все этапы центрифугирования при температуре 4 °C и держите все реагенты на льду.
5. Повторно суспендируйте клеточную гранулу ледяным 1,5 мл 1x PBS и раскрутите клетки при 500 x g и 4 °C в течение 3 мин. Выбросьте надосадочную жидкость><. заметка: Требуемые количества реагентов CER I, CER II и NER составляют соответственно 10, 0,55 и 5 объемов расчетного объема упакованных клеточных гранул; В следующем протоколе предполагается объем 20 мкл. Мы рекомендуем готовить только необходимое количество реагента CER I.
6. Добавьте 200 мкл ледяного цитоплазматического экстракционного реагента (CER I) с добавлением 2 мкл 1x ингибитора протеиназы, например, разведите 1 таблетку ингибитора протеазы (без ЭДТА) в 500 мкл воды для получения 100x запаса. Этого количества реагента CER I достаточно для лизирования 20 мкл объема клеточной гранулы.
   1. Чтобы оценить объем упакованной клеточной гранулы, сравните пробирку, содержащую клеточную гранулу, с пробиркой объемом 1,5 мл, заполненной 10, 20, 50 или 100 мкл 1x PBS.
7. Повторно суспендируйте клеточную гранулу, энергично вращая пробирку в течение 15 с, и инкубируйте пробирку на льду в течение 10 мин. Добавьте в пробирку 11 мкл ледяного реагента для цитоплазматической экстракции II (CER II), энергично завихривайте в течение 5 с и инкубируйте в течение 1 мин на льду.
Энергично перемешайте
8. в течение 5 с и центрифугируйте пробирку при 16 000 x g и 4 °C в течение 5 мин. Перенесите надосадочную жидкость в чистую предварительно охлажденную пробирку на льду. Надосадочная жидкость представляет собой цитоплазматическую фракцию, которая в дальнейшем используется в эксперименте по вытягиванию РНК.
9. Оставшуюся гранулу ресуспендировать в 100 мкл ледяного реагента для ядерной экстракции (НЭР) с добавлением 1 мкл ингибитора протеиназы (100x) и энергично перемешать в вихре в течение 15 с. Мы рекомендуем готовить только необходимое количество реагента NER с добавлением ингибиторов протеазы.
10. Образец инкубируют на льду в течение 40 мин с периодическим вихревым движением в течение 15 с (каждые 10 мин).
11. Центрифугируйте пробирку при давлении 16 000 x g в течение 10 мин. Перенесите надосадочную жидкость (это ядерная белковая фракция) в чистую предварительно охлажденную пробирку.
12. Немедленно измерьте концентрацию белка бицинхоновым (BCA) методом (см. Таблицу материалов). Для контроля чистоты белка каждой фракции проводят иммуноблоттинг (рис. 1) в отношении α-тубулина (положительное обнаружение только в цитозольной фракции) и поли-АДФ-рибозной полимеразы - PARP (положительное обнаружение только в ядерной фракции).
13. Для того чтобы сохранить активность белков и их нативное состояние, приготовьте 25 мкл аликвот цитозольных и ядерных экстрактов. Заморозьте эти аликвоты, поместив их в жидкий азот на 5 секунд, и храните непосредственно при температуре -80 °C.

2. Мечение РНК дестиобиотином

1. Коммерчески синтезировать РНК-зонды и очистить ВЭЖХ. Ресуспендирование безнуклеазной водой в концентрации 10 мкМ.<бр/> заметка: Последовательности зондов перечислены в таблице 1.
2. Используйте 50 пмоль РНК на реакцию вытягивания РНК. Разморозьте и держите на льду все реагенты, за исключением ПЭГ 30%, используемого для маркировки 3'-конца олиго РНК.
3. Перенесите 5 мкл 10 μМ РНК-зондов, помеченных как CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) и Unrelated-RNA (IRE), в тонкостенные микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл и инкубируйте в ПЦР-аппарате при 85 °C в течение 5 мин. Немедленно поместите пробирки на лед.
   заметка: Этот шаг важен, так как он способствует ослаблению и доступности РНК-зонда для мечения.
4. Для проведения одной реакции объемом 30 мкл добавьте в РНК-содержащую пробирку следующую смесь объемом 10 мкл: 3 мкл воды, не содержащей нуклеазы, 3 мкл 10-кратного реакционного буфера РНК-лигазы, 1 мкл ингибитора РНКазы (40 Ед/мкл), 1 мкл дестиобиотинилированного цитидинбисфосфата (1 мМ) и 2 мкл Т4 РНК-лигазы (20 Ед/мкл).
   заметка: Для приготовления мастер-смеси А для 3 образцов в избытке (3,2) смешайте 9,6 мкл воды, не содержащей нуклеаз, 9,6 мкл 10x реакционного буфера РНК-лигазы, 3,2 мкл ингибитора РНКазы (40 Ед/мкл), 3,2 мкл дестиобиотинилированного цитидина бисфосфата (1 мМ) и 6,4 мкл Т4 РНК-лигазы (20 Ед/мкл).
5. Осторожно добавьте 15 μL PEG 30% в реакцию. Используйте еще один совет, чтобы перемешать реакцию. Инкубируйте реакцию в течение ночи при 16 °C.
6. На следующий день приготовьте следующее: 5 М NaCl (свежий/без нуклеаз), хлороформ: изоамиловый спирт в соотношении 24:1 (например, на реакцию - 96 мкл хлороформа и 4 л изоамилового спирта), ледяной 100% этанол и ледяной 70% этанол.
7. Добавьте 70 мкл воды, не содержащей нуклеаз, в реакционные пробирки для мечения РНК. Добавьте 100 μл хлороформа: изоамиловый спирт и быстро перемешайте. Вращение вниз при 13 000 x g в течение 3 мин. Аккуратно удалите ТОЛЬКО верхнюю фазу и перенесите в новую безнуклеазную пробирку объемом 1,5 мл; Избегайте прикосновения к нижней фазе.
8. Добавьте 10 мкл 5 М NaCl, 1 л гликогена и 300 мкл ледяного 100% этанола. Поместите трубку при температуре -20 °C на 2 ч.<бр/> заметка: На этом этапе эксперимент может быть продолжен на следующий день.
9. Центрифугируйте при 13 000 x g и 4 °C в течение 15 мин. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, не повреждая гранулы. Добавьте 300 μL ледяного 70% этанола и снова центрифугируйте при 13 000 x g и 4 °C в течение 5 минут.
10. Полностью выбросьте надосадочную жидкость и высушите гранулу на воздухе (15 минут). Ресуспендируйте гранулу в 20 μл воды, не содержащей нуклеаз.
    заметка: Продолжайте вытягивание РНК в тот же день.
11. Инкубируйте РНК при температуре 90 °C в течение 2 минут и поместите ее на лед. Поместите меченую РНК на лед на следующем этапе предварительной промывки магнитных шариков стрептавидина.
    заметка: Более длительное время инкубации может повредить РНК-зонд.

3. Вытягивание РНК-белка

1. Предварительная промывка стрептавидин-магнитных шариков и инкубация с дестиобиотин-РНК
   1. Используйте 50 мкл магнитных шариков стрептавидина на 50 пмоль РНК. Однако это должно быть оптимизировано в зависимости от эксперимента.
   2. Закрутите пробирку стрептавидин-магнитными шариками в течение 15 с и быстро удалите 200 мкл (мастер-микс; достаточно для реакции 3+1) в чистую пробирку объемом 1,5 мл с безопасным замком с помощью срезанных наконечников для пипетки. Поместите трубку на магнитную подставку так, чтобы бусины собрались сбоку от трубки и подождите 1 минуту. Удалите жидкость для повторного суспензирования.
   3. Чтобы промыть шарики, снимите трубку с магнитной подставки, добавьте 400 μL 0,1 М NaOH и 0,05 М раствора NaCl и аккуратно несколько раз проведите пипеткой вверх и вниз. Поместите трубку обратно на магнитную подставку. Подождите 1 минуту и соберите надосадочную жидкость. Повторите этот шаг еще раз.
   4. Промойте шарики 200 мкл 100 мМ NaCl. Удалите надосадочную жидкость.
   5. Добавьте 200 мкл 20 мМ Трис (pH 7,5), ресуспендируйте шарики пипетированием, поместите пробирку на магнитную подставку, подождите 1 минуту и удалите надосадочную жидкость. Повторите этот шаг.
   6. Снимите пробирку с магнитной подставки, добавьте 200 мкл 1x буфера для захвата РНК и ресуспендируйте магнитные шарики стрептавидина путем кратковременного вортексирования. Удалите 50 мкл магнитных шариков стрептавидина и добавьте в каждую помеченную РНК-пробирку с помощью отрезанного наконечника для пипетки. Инкубируйте трубки в течение 30 минут при комнатной температуре на ролике.
2. Связывание белка с РНК
   1. Поместите трубки в магнитную подставку, подождите 1 минуту и удалите надосадочную жидкость.
   2. Добавьте 50 мкл 20 мМ Трис (pH 7,5) в гранулы и ресуспендируйте с помощью пипетирования. Поместите трубки в магнитную подставку, подождите 1 минуту и удалите надосадочную жидкость. Повторите этот шаг.
   3. Добавьте 100 мкл 1x белок-РНК-связывающего буфера в гранулы и ресуспендируйте с помощью пипетирования.
   4. Тем временем приготовьте следующую смесь: 10 мкл 10-кратного буфера, связывающего белок-РНК, 30 мкл 50% глицерина, 50 мкг цитоплазматических белков и безнуклеазную воду до 100 мкл<бр/> заметка: Приготовьте мастер-смесь B для 3 образцов в избытке (3,3) следующим образом: 33 мкл 10x белок-РНК-связывающего буфера, 99 мкл 50% глицерина, 165 мкг цитоплазматических белков и безнуклеазную воду до 330 мкл. Держите пробирку с мастер-смесью B на льду.
   5. Поместите трубки в магнитную подставку, подождите 1 минуту и соберите надосадочную жидкость. Добавьте 100 μл мастер-смеси B, повторно суспендируйте путем осторожного пипетирования вверх и вниз, избегая образования пузырьков. Инкубируйте реакционные пробирки в течение 60 минут при 4 °C на ролике.
3. Стирка и элюирование
   1. Поместите трубки в магнитную подставку, соберите надосадочную жидкость (которая протекает через - FT), и перенесите ее в новую трубку.
      заметка: Держите этот FT на льду для последующего анализа.
   2. Нанесите пипетку 100 мкл буфера 1x Wash на шарики, осторожно суспендируйте, поместите обратно в магнитную подставку, подождите 1 минуту и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг 2 раза.
   3. Добавьте 40 μL элюирующего буфера в магнитные шарики, перемешайте пипетированием вверх и вниз и инкубируйте при 37 °C в вибростенде (950 об/мин) в течение 30 минут.
   4. Поместите пробирки в магнитную подставку, подождите 1 минуту и соберите элюированный образец (который элюат - Е). Положите на лед и используйте для последующего анализа.
      заметка: На этом этапе каждый тестируемый РНК-зонд состоит из проточного (FT) и элюирующего (E) образца.

Результаты

Рисунок 1: Вестерн-блоттинг 5 мкг цитозольной и ядерной белковой фракции. Белок PARP присутствует в ядерной фракции (N), но отсутствует в цитозольной (C) фракции. α-тубулин присутствует в цитозольной фракции (С), но отсутствует в ядерной фракции (N).

Таблица 1: Последовательности РНК-зондов

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
NE-PER Набор для ядерной и цитоплазматической экстракции	Thermo Fisher Scientific	78833
Таблетки ингибитора протеазы для пирса, без ЭДТА	Thermo Fisher Scientific	А32965
Набор для анализа белка BCA от Pierce	Thermo Fisher Scientific	No 23225
Набор для вытягивания магнитной РНК-белка Pierce	Thermo Fisher Scientific	20164	В комплект входят магнитные шарики, поэтому набор необходимо хранить при температуре 4 °C
Набор для дестиобиотинилирования Pierce RNA 3' End	Thermo Fisher Scientific	20163	Набор является частью "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" и должен храниться при температуре -20 °C, в отличие от вытягивающего набора (4 °C).
DynaMag-2, магнитный стенд	Thermo Fisher Scientific	12321Д
RPMI - 1640 средний	Сигма-Олдрич	Р8758
FBS - Фильтрованная сыворотка крупного рогатого скота	Пан Биотех	П40-37500
Пенициллин - стрептомицин (100х)	Сигма-Олдрич	П4333
Раствор L-глютамина (200 мМ)	Сигма-Олдрич	Г7513
0,25% трипсин-ЭДТА (1 шт.)	Технологии Gibco от Life	No 25200-056
Решение для обеззараживания РНКазы Zap	Thermo Fisher Scientific	АМ9780
Синтез олиго РНК	Mycrosynth AG, Швейцария	- T	Масштаб синтеза - 0,04 мкм - очищенный ВЭЖХ
Бычий сывороточный альбумин	Сигма-Олдрич	А7030
Соляная кислота (HCl) 6 м	PanReac AppliChem	182883.1211 (Английский)
Ultra Pure 1 М Трис, pH 7,5	Thermo Fisher Scientific	15567027
глицерин	Thermo Fisher Scientific	17904	50% стерильных аликвот для хранения при -20°C
Магнитные бусины Pierce Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	88817	Обратите внимание, что эти магнитные шарики имеют средний диаметр 1 мкм (диапазон от 0,5 до 1,5 мкм). Кроме того, стрептавидин Dynabeads-M280, представляющий собой шарики с однородным размером 2,8 мкм, также используется в РНК-pulldown, но имейте в виду, что это может повлиять на процесс очистки.
Сульфат-(14-18)-гидрат алюминия	Сигма-Олдрич	368458
Ортофосфорная кислота	Апплименем	А0637

г. г. г.