$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Реакция связывания белка и разделение связанной РНК
- Осуществить связывание белка и РНК в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5 в объеме 100 мкл путем добавления к этим конечным концентрациям следующих ингредиентов: 50 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0,09 мкг/мкл бычьего сывороточного альбумина, 0,5 ЕД/мкл РНКазин, 0,15 мкг/мкл тРНК, 1 мМ ЭДТА, и 30 мкл соответствующей концентрации рекомбинантного белка (ПТБ). Добавьте РНК из соответствующего пула.
заметка: Фактор сплайсинга U2AF65 обычно связывается с сайтами сплайсинга полипиримидинового тракта/3' модельных интронов с аффинностью связывания (константа диссоциации равновесия или Kd) примерно 1–10 нМ. Таким образом, в первых двух раундах связывания использовалась концентрация белка в 10 раз выше Kd для U2AF65; для белков SXL и PTB начальная концентрация в этом диапазоне была только нашим лучшим предположением. Это гарантировало, что желаемые виды РНК могут связываться, хотя последовательности с более низким сродством также потенциально связываются. В раундах 3 и 4 (транскрипция, связывание и амплификация) концентрация белка снижалась в три раза. Это было сделано для успешной элиминации низкоаффинных видов РНК.
- Поместите пробирки, содержащие реакции связывания, примерно на 30 минут при температуре 25 °C в температурный блок (или на лед).
- Фракционируйте связанную РНК из несвязанной РНК в течение первых 4 раундов селекции-амплификации, используя следующие шаги.
- Отфильтровать образец (100 мкл) при комнатной температуре через нитроцеллюлозный фильтр, прикрепленный к вакуумному коллектору><.
заметка: Комплекс РНК-белок, но не несвязанная РНК, остается на фильтре.
- Измельчите фильтр с оставшейся РНК на фрагменты стерильным лезвием бритвы и вставьте их в центрифужную пробирку. Восстановите РНК, осторожно переворачивая пробирку в течение как минимум 3 часов (или на ночь) с помощью фильтрующих кусочков, погруженных в буфер протеиназы K (PK).
- Депротеинизируйте образец РНК путем его вортексирования в присутствии равного объема фенол-хлороформа (1:1), а затем хлороформа. Каждый раз восстанавливайте водную фазу, центрифугируя образец на высокой скорости в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Смешайте его с ацетатом натрия (0,1 объема 3,0 М, pH 5,2) и этанолом (2–3 объема абсолютного этанола, 200 proof). Оставьте пробирку в морозильной камере при температуре -80 °C на 30 минут, центрифугируйте на высокой скорости в течение 10 минут и, следуя этапам промывки и сушки, растворите РНК в воде, обработанной DEPC.
- Отделите связанные с белком фракции РНК от несвязанных фракций в течение последних 2 раундов (раунды 5 и 6; транскрипция, связывание и амплификация) следующим образом. Уменьшите концентрацию белка в реакции связывания еще в три раза для создания дополнительного давления отбора для обогащения высокоаффинных связывающих последовательностей и преимущественного удаления низкоаффинных последовательностей.
- Предварительно нанесите нативный полиакриламидный гель (5% с соотношением 60:1 акриламид:бис-акриламид) в 0,5-кратный буфер TBE (Трис-Борат-ЭДТА) перед началом вышеуказанной реакции связывания РНК:белок (этап 1.1). Электрофорирование этого геля в холодном помещении (4 °C) путем применения напряжения 250 В на 15 минут.
- Пипеткой проводите описанные выше реакции связывания РНК:белок (шаг 1.1) в различные лунки этого геля.
заметка: Белок хранят при температуре -80 °C и разбавляют перед использованием в 20 мМ 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновой кислоты (HEPES), pH 8,0, 20% глицерина, 0,2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,05% NP-40 и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Добавление 0,5–1,0 мМ ингибитора протеазы фенилметансульфонилфторида (PMSF) является необязательным. В реакции связывания этот буфер вносит около 6% глицерина, что позволяет напрямую загружать образцы в лунки без необходимости смешивания их с отдельным буфером для загрузки геля.
- Фракционировать связанную РНК из несвязанной РНК с помощью гель-электрофореза в холодном помещении (4 °C) при напряжении 250 В в течение 1–2 ч. Этот процесс также известен как анализ сдвига подвижности геля.
Примечание: Продолжительность электрофореза варьируется в зависимости от особенностей РНК и белка, используемых для связывания.
- Поместите гель на рентгеновскую пленку и определите расположение связанной РНК с помощью авторадиографии. Вырежьте гелевый срез со связанной РНК и вставьте его в пробирку.
- Измельченный срез геля инкубируйте в буфере PK, используемом для элюирования, в течение 3 часов или на ночь.
- Энергично воздействуйте на элюированный образец РНК сначала фенол-хлороформом, а затем хлороформом.
- Смешайте ацетат натрия и этанол с водной фазой после экстракции хлороформом. После инкубации в морозильной камере при температуре -80 °C вращайте при 4 °C в течение 5–10 минут, чтобы собрать гранулы РНК. Промойте гранулу РНК этанолом и высушите на воздухе, оставив крышку тюбика открытой. Растворите РНК в воде, обработанной DEPC.
заметка: Переключение на анализ сдвига подвижности геля для фракционирования позволяет устранить нежелательные виды РНК, которые могли быть обогащены для связывания, например, с фильтром из нитроцеллюлозы (или любой другой матрицей), используемым в начальных раундах фракционирования.
2. Обратная транскрипция и ПЦР-амплификация
- Синтезируйте кДНК из растворенной РНК с использованием обратной транскриптазы и обратного праймера путем инкубации реакции объемом 20 мкл (2 мкл 10x RT буфера, 2 мкл обратной транскриптазы AMV, 1 мкМ обратный праймер, 10 мкл РНК, необязательный ингибитор РНКазы) при 42 °C в течение 60 мин.
- Амплифицируйте кДНК с помощью 20–25 циклов ПЦР. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) прикрепите промотор РНК-полимеразы Т7 к библиотеке, содержащей 1 мкМ матрицы случайной библиотеки ДНК, 1 мкМ каждого праймера, 20 мМ Трис (pH 8,0), 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, 0,1 мкг/мкл ацетилированного бычьего сывороточного альбумина, 2 единицы Taq-полимеразы и по 200 мкМ дНТФ (дезоксигуанозин, дезоксиаденозин, дезоксицитидин и дезокситимидинтрифосфат).
3. Транскрипция и связывание с белками
- Повторите процесс синтеза РНК, связывания белка и разделения связанных с белком и несвязанных фракций.