Микромасштабный термофорез для изучения белок-липидных взаимодействий в растворе

Аннотация

Источник: Sparks, R. P. et al., Использование микромасштабного термофореза для измерения белок-липидных взаимодействий.J. Vis. Exp.(2022)

Это видео демонстрирует микромасштабный термофорез для изучения белок-липидного взаимодействия. Анализ обнаруживает взаимодействие между молекулами путем количественной оценки термофоретического движения флуоресцентно-меченых белков в ответ на температурный градиент. Флуоресцентную молекулу смешивают с различными концентрациями нефлуоресцентных молекул липидов, и смесь молекул в растворе загружают в капилляры. К образцам в капиллярах применяется температурный градиент, а движение флуоресцентной молекулы в градиенте температуры обнаруживается и регистрируется.

Протокол

1. Подготовка материалов

1. Готовят фосфатно-солевой буфер (PBS): 137 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ₂PO₄ и 2 мМ KH₂PO_4, pH 7,4.
2. Приготовьте краситель NTA-Atto 647 N. Разбавьте стоковый краситель NTA-Atto 647 N до 100 нМ из 100% раствора ДМСО в PBS без твина.
3. Express Vam7-His8 – белок в качестве гибридного белка в E. coli и его очистка с помощью Ni-NTA и эксклюзионной хроматографии.
4. Титруйте аналит в буфере PBS. Если аналит находится в другом буфере, меченый MST не особенно чувствителен к незначительным отличиям буфера от молекул, таких как ДМСО, если только содержимое буфера аналита не взаимодействует с меченым белком.

2. Подготовка устройства MST

1. Включите выключатель питания на задней панели устройства.
2. Откройте управляющее программное обеспечение и убедитесь, что ноутбук включен и подключен к компьютеру, подключенному к устройству.
3. Введите настройки флуоресценции и MST для этого эксперимента. Установите MST Before на 3 s, MST на 30 s и Recovery (Fluo)через 1 с. Перед этим измеряет начальную флуоресценцию и не требует длительного времени; MST — это фактическое количество времени, за которое должно быть достигнуто равновесие после индукции тепла.
4. Таблица капилляров: Для каждой капиллярной трубки введите название мишени (лиганда), название лиганда (аналита), концентрацию мишени и самую высокую концентрацию титрования и используйте коэффициент титрования автозаполнения. Например, введите 50 нМ для целевой концентрации Vam7-His8, Vam7-His8 для названия мишени, Di-C8 PA для названия лиганда введите 50 нМ и самую высокую концентрацию лиганда, выбрав 1:1 и перетащив вниз до слотов автозаполнения 2-16.
5. Запустите сканирование крышек, чтобы выбрать подходящий светодиод (20% светодиод (предустановленный)) на основе сигнала целевого белка и отрегулируйте от 200 до 2000 единиц флуоресценции для меченого MST. Сканирование крышек должно показать однородные округлые колокольчатые пики.
6. Выберите диапазон мощностей MST и введите значения для каждого из них, чтобы проверить наиболее надежное прилегание креплений, и нажмите Start Cap Scan + Measurement, сканируя различные значения, чтобы определить наилучшие условия работы для данного тестируемого взаимодействия.
7. Определите мощность MST с наилучшим соответствием с помощью аналитического программного обеспечения и предустановки для термофореза с помощью Tjump. Проанализируйте подгонку в соответствии с наибольшим расстоянием флуоресценции между самой низкой и самой высокой концентрацией по сравнению с мощностью MST с наилучшим соответствием и выберите мощность MST для повторных испытаний.
8. Определите, произошло ли фотообесцвечивание между первым и вторым прогоном, перейдя в программное обеспечение для анализа и переключив анализ в экспертный режим. Далее выберите для анализа флуоресценцию вместо термофореза. Выберите экспертный режим, а затем фотообесцвечивание.

3. Подготовка образцов для меченого MST

1. Доведите раствор Vam7-His8 до концентрации 200 нМ в PBS без Tween.
2. Доведите краситель NTA-Atto 647 до 100 нМ в PBS без Tween.
3. Смешайте краситель Vam7-His8 и NTA-Atto 647 в объемном соотношении 1:1 и оставьте его при комнатной температуре, защищенной от света, в течение 30 мин. Определите подходящую концентрацию целевого белка, как описано в разделе 2.5 (см. Добавку по утилизации KD красителя Ni-NTA, как показано в видео).
4. Центрифужная смесь красителя NTA-Atto 647 N и белка в течение 10 мин в темном помещении с использованием настольной центрифуги при плотности примерно 8,161 х г.
5. Храните смесь при температуре 4 °C после эксперимента или на льду во время эксперимента для повторного использования в течение нескольких часов, если это необходимо, чтобы предотвратить денатурацию белка.
6. Используйте анализатор концентраций NT для определения диапазона концентраций, необходимого для титрования.
7. Доведите Di-C8 PA до соответствующей максимальной концентрации в воде.
8. Титруйте аналит с помощью последовательного разведения 1:1 в буфере PBS для 16 концентраций по сравнению с предыдущим этапом. В отличие от SPR, термофорез не так чувствителен к разнице буферов.

4. MST образцов

1. Включите устройство и подключенный к нему ноутбук.
2. Нажмите стрелку вверх на передней части машины и выдвиньте капиллярную решетку.
3. Загрузите капилляры в стойку с наибольшей концентрацией в положении 1.
4. В управляющем программном обеспечении выберите красный канал, соответствующий NTA-Atto 647 N.
5. Введите информацию о концентрации, положении и названии для каждого капилляра в таблице капилляров.
6. Запустите сканирование капилляров, нажав кнопку Start Cap Scan на светодиоде 20% (предустановленный) и отрегулируйте соответственно от 200 до 2000 единиц флуоресценции, используя либо настройки интенсивности светодиодов, либо концентрацию лиганда (меченого белка).
7. Выберите диапазон мощности MST.
8. Запуск сканирования крышки + измерение MST.
9. Анализируйте с помощью программного обеспечения для анализа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Cy5 малеимид монореактивный краситель	GE Healthcare	PA23031	Для мечения белков
ГрафПад Призма	Программное обеспечение GraphPad
Капилляры Monolith NT.115 (1000 штук)	Нанотемпер	МО-К022	Капилляры для МСТ
Машина Монолит НТ.115	Нанотемпер		Оснащение университета
NTA-Atto 647 Н	сигма	2175	Этикетка для Его меток
Фосфатидилинозитол-3-фосфат diC8 (PI(3)P diC8)	эшелон	-3008	Липиды для экспериментов по связыванию

г.