Микромасштабный термофорез для изучения белок-липидных взаимодействий в растворе

Аннотация

Источник: Sparks, R. P. et al., Использование микромасштабного термофореза для измерения белок-липидных взаимодействий.J. Vis. Exp.(2022)

Это видео демонстрирует микромасштабный термофорез для изучения белок-липидного взаимодействия. Анализ обнаруживает взаимодействие между молекулами путем количественной оценки термофоретического движения флуоресцентно-меченых белков в ответ на температурный градиент. Флуоресцентную молекулу смешивают с различными концентрациями нефлуоресцентных молекул липидов, и смесь молекул в растворе загружают в капилляры. К образцам в капиллярах применяется температурный градиент, а движение флуоресцентной молекулы в градиенте температуры обнаруживается и регистрируется.

Протокол

1. Подготовка материалов

1. Готовят фосфатно-солевой буфер (PBS): 137 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ₂PO₄ и 2 мМ KH₂PO_4, pH 7,4.
2. Приготовьте краситель NTA-Atto 647 N. Разбавьте стоковый краситель NTA-Atto 647 N до 100 нМ из 100% раствора ДМСО в PBS без твина.
3. Express Vam7-His8 – белок в качестве гибридного белка в E. coli и его очистка с помощью Ni-NTA и эксклюзионной хроматографии.
4. Титруйте аналит в буфере PBS. Если аналит находится в другом буфере, меченый MST не особенно чувствителен к незначительным отличиям буфера от молекул, таких как ДМСО, если только содержи....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Cy5 малеимид монореактивный краситель	GE Healthcare	PA23031	Для мечения белков
ГрафПад Призма	Программное обеспечение GraphPad
Капилляры Monolith NT.115 (1000 штук)	Нанотемпер	МО-К022	Капилляры для МСТ
Машина Монолит НТ.115	Нанотемпер		Оснащение университета
NTA-Atto 647 Н	сигма	2175	Этикетка для Его меток
Фосфатидилинозитол-3-фосфат diC8 (PI(3)P diC8)	эшелон	-3008	Липиды для экспериментов по связыванию

г.