Методическая статья

Количественная проточная цитометрия для изучения меченых белково-фосфолипидных везикулярных взаимодействий

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Podoplelova, N. et al., Анализ взаимодействия флуоресцентно-меченых белков с искусственными фосфолипидными микровезикулами с помощью количественной проточной цитометрии. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео мы демонстрируем взаимодействие между белками и искусственными фосфолипидными везикулами с помощью количественной проточной цитометрии. Связывание флуоресцентно меченых белков с флуоресцентно мечеными фосфолипидными везикулами увеличивает среднюю интенсивность флуоресценции, и это увеличение обнаруживается проточным цитометром.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Обнаружение белок-липидного взаимодействия методом проточной цитометрии

  1. Эксперименты по кинетическому связыванию
    1. Разведите фосфолипидные везикулы в буфере Тироде (20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0,4 мМ2PO4, 2,5 мМ CaCl2, 5 мМ глюкозы, 0,5% БСА, pH 7,4) до концентрации 1 мкМ и общего объема 250 мкл.
    2. Смешайте меченный флуоресцентными источниками фактор свертывания крови Х (FX-fd) из стадии 1 в концентрации 500 нМ с фосфолипидными везикулами из стадии 1.1.1 в соотношении 1:1 (конечная концентрация везикул 0,5 мкМ, концентрация fX-fd составляет 250 нМ fX) до общего объема 500 мкл.
    3. Немедленно введите 500 мкл смешанной суспензии (~20 мин для анализа с низкой скоростью потока) в проточный цитометр. Используйте низкий расход и убедитесь, что пороговое значение для канала FL2 (возбуждение 488 нм, фильтр излучения 585/42 нм) равно 200. Измерьте среднюю флуоресценцию в канале FL4 (возбуждение 633 нм, эмиссионный фильтр 660/20) для флуоресцентного красителя из таблицы материалов.
      заметка: Выбирайте цитометр без автосамплера. Это позволит ускорить процесс введения образца в измерительную ячейку.
    4. При достижении насыщения связывания (отсутствие значительного увеличения флуоресценции в течение 5 мин) быстро разбавьте образец в 20 раз буфером Тайроде и контролируйте диссоциацию до тех пор, пока не будет достигнута исходная флуоресценция (полная диссоциация) или до тех пор, пока не будет достигнуто плато (отсутствие значительного снижения флуоресценции в течение 5 мин).
      заметка: В качестве контроля добавьте 10 мкМ ЭДТА и контролируйте полную диссоциацию в течение 5 минут.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 647 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир)Thermo Fisher ScientificА37573Флуоресцентный краситель
BD FACSCantoIIBD Bioscience
DiIC16(3) (1,1'-дигексадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат)Thermo Fisher ScientificД384Флуоресцентный краситель
ДмсоСигма ОлдричД8418
ХЕПЕССигма ОлдричН4034-500Г
L-α-фосфатидилсерин (мозг, свинья) (натриевая соль)Avanti Polar Lipids840032П
L-α-фосфатидилхолин (мозг, свинья)Avanti Polar Lipids840053П
Мини-экструдерAvanti Polar Lipids610020-1ЭА
Хлористый калийСигма ОлдричП9541-500Г
Кальция хлоридный, безводный, порошок, ≥97%Сигма ОлдричС4901-100Г
Натрия фосфат одноосновнойСигма ОлдричС3139-250Г
Хлорид натрияСигма ОлдричС3014-500Г
Хлорид магнияСигма ОлдричМ8266-100Г
Бычий сывороточный альбуминVWR Медико-биологические науки AMRESCOАМ-О332-0,1
Динатриевая соль ЭДТАVWR Медико-биологические науки AMRESCOАм-О105Б-0,1

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи