ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы следует фильтровать с помощью фильтра размером 0,22 мкм и дегазировать вакуумом в течение 1 часа.
1. Подготовка липидных везикул
- Используйте стеклянные пробирки объемом 2 мл. Растворите каждый липид, 1,2-диолеол-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (POPC), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин (СОЗ) и холестерин (Chol), в смеси хлороформа/метанола (50:50 v/v) для получения прозрачного липидного раствора 5 мМ. Растворите 1,2-диолеол-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-мио-инозитол-4',5'-бисфосфат) (PI(4,5)P2) в смеси хлороформ/метанол/вода (20:9:1 v/v).
- Объедините растворенные липиды в желаемом молярном соотношении POPC/POPS (80/20), POPC/PI(4,5)P2 (95/5), POPC/POPS/Chol (60/20/20), POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (60/17/3/20) и POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (37/20/20/3/20) (Таблица 1) в стеклянных пробирках объемом 10 мл.
заметка: Итоговое количество общего липида составляет 500 мкг.
- Испаряйте органические растворители с помощью сухой струи азота. Оставьте липидную смесь в системе высокого вакуума (лиофилизации) на 3 часа, чтобы удалить любые остаточные следы растворителей.
заметка: В результате получается сухая прозрачная пленка.
- Ресуспендируйте липидную пленку в 1 мл цитратного буфера (10 мМ трисодий-цитрата, 150 мМ NaCl, pH 4,6). Инкубируйте липидную суспензию при 60 °C (эта температура примерно на 10 °C выше температуры фазового перехода самого высокого плавящегося липида в смеси) в течение 30 минут на водяной бане и энергично переворачивайте ее каждые 5 мин.
заметка: Это приводит к образованию крупных многослойных везикул (MLV). Держите суспензию выше температуры перехода.
- Предварительно разогрейте экструдер (в данном случае при 60 °C), оснащенный поликарбонатной мембраной диаметром 50 нм, выше температуры перехода (которая здесь составляет 40 - 50 °C) в течение 30 минут.
- Загрузите суспензию MLV в предварительно разогретый экструдер и аккуратно пропустите смесь 31x через поликарбонатную мембрану, чтобы образовались небольшие однослойные везикулы (внедорожники). Поддерживайте температуру выше температуры перехода.
- Переложите суспензию внедорожника в пластиковый реакционный сосуд объемом 2 мл и добавьте буфер для цитрата (см. шаг 1.4), чтобы довести конечный объем до 2 мл<бр/>
заметка: В результате конечная концентрация липидов составит 250 мкг/мл.
2. Работа с кварцевыми датчиками
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда обращайтесь с кварцевыми датчиками с помощью пинцета.
- Инкубируйте четыре датчика, вставленные в держатель политетрафторэтилена, в 2% раствор SDS в течение ≥ 30 мин. Тщательно промойте их сверхчистой водой, чтобы полностью удалить SDS, и дайте им высохнуть, используя струю сухого аргона или азота.
- Используйте систему плазменной очистки для полного удаления любых загрязнений. Вставьте сухие датчики в камеру плазменной очистки, опорожните камеру и промойте ее кислородом 3 раза. Включите плазменный очиститель. Используйте следующие параметры процесса: давление 1 x 10-4 торр, высокая мощность радиочастоты (РЧ) и время обработки 10 минут. Выключите машину и выньте датчики.
3. Работа микровесов
ПРИМЕЧАНИЕ: Использовалась система микровесов с четырьмя температурными проочными камерами в параллельной конфигурации, подключенными к перистальтическому насосу и настроенными на расход 80 μл/мин. В режиме открытого потока буфер откачивался из питательного резервуара в приемный резервуар. В контурном режиме приемный бак подключался к питательному резервуару для создания замкнутого контура. Температура была установлена на уровне 20 °C.
- Осторожно пристыкуйте очищенные от плазмы датчики к 4 проточной камере с помощью пинцета. Избегайте любого давления или скручивания камер и трубок, которые могут привести к утечке.
- Промыть систему цитратным буфером (10 мМ трисотрий-цитрат, 150 мМ NaCl, pH 4,6) в режиме открытого потока в течение 10 мин.<бр/>
заметка: Для этого требуется ровно 3,2 мл буфера, но желательно использовать избыточный буфер (10 мл).
- Запустите программу. Начните записывать любые изменения частоты и диссипации первого основного тона (n = 1-го) и обертонов (n = 3-го - 13-го) с помощью программного обеспечения, пока частота и базовая линия диссипации не станут стабильными (это займет около 40 - 60 минут).
заметка: Уровни частотного шума (peak-to-peak) должны быть ниже 0,5 Гц и, для дипсипации, ниже 0,1·10-6, с максимальным дрейфом (в водном растворе) 1 Гц/ч по частоте и 0,3·10-6/ч по диссипации.
- Когда исходные показатели стабилизируются, применяйте суспензию SUV в цитратном буфере (2 мл в небольшой пробирке). С помощью реакционного сосуда удалите 1,5 мл мертвого объема. Затем закройте систему в режиме loop-flow. Запишите сдвиг частоты/рассеивания в течение еще 10 минут.
заметка: В течение этого времени везикулы распространяются на поверхность SiO2 и сливаются, образуя непрерывный бислой (шаг 2 на рисунках 1, рисунке 2 и рисунке 3). Адсорбция внедорожников на поверхности датчика является двухфазной и имеет типичную частоту, минимум и максимум в рассеивании. Стабильная новая базовая линия частоты/диссипации с характерным сдвигом частоты (в зависимости от липидного состава) в диапазоне от 26 до 29 Гц (см. таблицу 1) указывает на непрерывный бислой на поверхности.
- Когда SLB стабилен (см. шаг 3.4), уравновесьте систему с рабочим буфером (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, pH 7,4) в требуемых концентрацияхCa2+ (в диапазоне от 50 мкМ до 1 мМ CaCl2, в зависимости от эксперимента) в режиме открытого потока в течение 40 мин.
- Добавьте белок (в данном случае AnxA2) в буфер, содержащий Ca2+ (см. шаг 3.5). Выполняйте применение белка в режиме петлевого потока до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное устойчивое состояние (шаг 3 на рисунках 1, 2 и 3).
заметка: Концентрация белка может находиться в диапазоне от 1 до 400 нМ. Адсорбция белка приводит к зависимому от концентрации сдвигу частоты, отражающему массовую (белковую) адсорбцию.
- Диссоциацию связанного белка путем хелатирования ионов Ca2+ с 5 мМ EGTA в работающем буфере в режиме открытого потока (шаг 4 на рисунках 1 и рисунке 2).
заметка: Восстановление частоты и диссипации к исходному уровню SLB указывает на полную обратимость связывания белка. Циклы ассоциации-диссоциации могут повторяться для сравнения различных концентраций или белков.
