$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Визуализация образования конденсации EWS-FLI1 на ДНК-занавесках
- Откройте программу для работы с изображениями, найдите и отметьте положения зигзагообразных узоров 3 × 3 под светлым полем.
- Включите поток со скоростью 0,2 мл/мин, чтобы окрашивать ДНК двухцепочечным красителем ДНК на 10 минут.
- Разбавьте mCherry-EWS-FLI1 буфером для визуализации до концентрации 100 нМ в 100 мкл в пробирке.
- Загрузите образец белка через клапан с помощью стеклянного шприца объемом 100 мкл и измените скорость потока на 0,4 мл/мин.
- Включите лазер с длиной волны 488 нм и предварительно просканируйте каждую область, чтобы проверить состояние распределения ДНК; выберите область, где молекулы ДНК распределяются равномерно. Установите мощность лазера на 10% для лазера с длиной волны 488 нм и 20% для лазера с длиной волны 561 нм. С помощью измерителя мощности измерьте реальную мощность лазера вблизи призмы: 4,5 мВт для лазера с длиной волны 488 нм и 16,0 мВт для лазера с длиной волны 561 нм.
- Получение изображений
- Начните получать изображения с интервалом в 2 с с помощью лазеров с длиной волны 488 нм и 561 нм одновременно.
- Переключите клапан из ручного режима в режим инъекции, чтобы буфер визуализации промывал образец белка в проточную ячейку через 60 с.<бр/>
заметка: Этот процесс займет ~30 с, и поле зрения будет покрыто сигналами mCherry, как только белки EWS-FLI1 достигнут проточной ячейки.
- Чтобы удалить свободный EWS-FLI1, продолжайте промывать проточную ячейку буфером для визуализации в течение 5 минут при включенном лазере с длиной волны 561 нм. Остановите поток и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 10 минут.
- Включите поток со скоростью 0,4 мл/мин, чтобы ДНК расширилась, и получайте изображения с интервалом в 2 секунды между различными кадрами для получения высокопроизводительных данных об образовании конденсата EWS-FLI1.
2. Анализ интенсивности для mCherry-EWS-FLI1
- Импортируйте данные в виде последовательностей изображений в программное обеспечение ImageJ, выберите точки на 25× участках GGAA в квадрате 8×8 пикселей и сохраните изображение в .tif формате.
- Рассчитайте интенсивность как сумму интенсивности в квадрате 8×8 пикселей, включая всю пункту, и удалите фон, вычитая интенсивность фона в области того же размера рядом с квадратом 8 x 8 пикселей.