Анализ модуляции pH на поддерживаемых липидных бислоях для обнаружения белок-фосфоинозитидных взаимодействий

Аннотация

Источник: Shengjuler, D., et al., PIP-on-a-chip: исследование белково-фосфоинозитидных взаимодействий без меток. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео мы демонстрируем взаимодействия белка и фосфоинозитида в микрофлюидной картине с использованием анализа модуляции pH, используя чувствительный к pH флуоресцентный краситель, помеченный липидом фосфатидилэтаноламина, поддерживаемого липидного бислоя, называемого микрофлюидной платформой. Модуляции рН после связывания белка с фосфолипидами вызывают гашение флуоресценции.

Протокол

1. Формирование поддерживаемых липидных бислоев (SLB)

1. Перелейте 100 мкл PI(4,5)P2-содержащих внедорожников в микроцентрифужную пробирку объемом 0,65 мл. Отрегулируйте pH раствора до ~3,2, добавив 6,4 мкл 0,2 Н соляной кислоты.
   заметка: Подтвердите pH раствора с помощью рН-метра, оснащенного микрорН-зондом (см. таблицу материалов).
2. Нанесите пипетку по 10 мкл раствора SUV с регулируемым pH в каждый канал через входное отверстие и подавайте давление через пипетку до тех пор, пока раствор не достигнет выходного отверстия. Отсоедините наконечник от пипетки и оставьте его прикрепленным к устройству.
3. Повторите описанный выше шаг для каждого канала, а затем инкубируйте устройство в течение 10 минут при RT.
   заметка: Введение везикул в микроканалы должно выполняться сразу после сборки устройства.
4. Отрежьте комплекты входных и выходных трубок длиной 60 см (входная трубка) и 8 см (выпускная трубка) соответственно.
   заметка: Разрезание трубки по диагонали и создание острого края облегчает вставку трубки во входные и выходные отверстия. Выпускная трубка должна иметь дугообразную форму. Длина входной трубки может варьироваться в зависимости от конфигурации микроскопа. Внутренний диаметр трубки составляет 0,05 см.
5. С помощью пинцета подсоедините к прибору набор выходных трубок, а затем прикрепите прибор к предметному столику микроскопа.
6. Погрузите один конец входной трубки в 25 мл рабочего буфера, содержащегося в конической трубке, и обмотайте его лентой, чтобы убедиться, что трубка надежно закреплена.
7. Поместите коническую трубку на возвышенность (~20 см), чем устройство, чтобы протолкнуть раствор через микроканалы под действием силы тяжести; для этого можно использовать лабораторный домкрат.
8. Для каждой впускной трубки с помощью шприца наберите 1 мл рабочего буфера со свободного конца трубки. Извлеките наконечник пипетки из впускного отверстия и вставьте свободный конец входной трубки в устройство.
   заметка: Введите каплю буфера на входное отверстие, чтобы снизить вероятность попадания пузырьков воздуха в канал на этом этапе. После того, как впускная трубка будет прикреплена к устройству, используйте безворсовую салфетку, чтобы удалить излишки буфера.
9. Повторите описанный выше шаг, чтобы подсоединить все части входных трубок к устройству.
   заметка: Протекающий бегущий буфер через каналы помогает удалить излишки везикул и уравновесить бислой до экспериментальных условий.
10. Откройте программное обеспечение для управления микроскопом (см. таблицу материалов). На левой панели нажмите на вкладку «Микроскоп» и выберите объектив «10X».
11. Нажмите на иконки изображений «Live», а затем «Alexa 568» на панели инструментов. С помощью ручек тонкой регулировки и регулировки курса сосредоточьтесь на микроканалах.
12. Просканируйте устройство, чтобы проверить качество SLB и каналов (рис. 1). Затем нажмите на иконку изображения «FL Shutter Closed» на панели инструментов.
13. Перейдите на вкладку «Получение» и в разделе «Основные настройки» выберите «Время экспозиции». Установите время экспозиции на «200 мс».
14. На левой панели нажмите на «Многомерное получение» и в меню фильтров выберите красный канал (помечен как «Alexa 568»). Затем нажмите на меню «Таймлапс», установите временной интервал 5 минут, продолжительность 30 минут и нажмите «Начать».
    заметка: Исходя из продолжительности (30 мин) и скорости потока (~1,0 мкл/мин), 30 мкл рабочего буфера используется для уравновешивания SLB в канале, т.е. 240 мкл рабочего буфера используется для всех 8 каналов.
15. Выберите инструмент "Круг" на вкладке "Измерить" и нарисуйте круг в любом канале. Щелкните правой кнопкой мыши, когда круг выделен, и выберите «Свойства». На вкладке "Профиль" отметьте "all T", чтобы увидеть интенсивность флуоресценции в зависимости от времени.
    1. Убедитесь, что эта кривая достигает плато, которое указывает на равновесие, прежде чем переходить к следующему шагу.
16. Опустите буферный раствор на такую же землю, как устройство для остановки потока.
17. Сохраните файл замедленной съемки.

2. Тестирование взаимодействия домена PLC-δ1 PH с PI(4,5)P2-содержащими SLB

1. Готовьте разведения домена PH, используя в качестве разбавителя работающий буфер.
   заметка: Поскольку в устройстве восемь каналов, используйте по крайней мере два из них для пустого управления. Выберите дальние концы с каждой стороны и используйте оставшиеся каналы для разведения белка. Были протестированы следующие концентрации в домене PH: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 и 2,50 мкМ. Приблизительно 200 мкл каждого разведения было достаточно для достижения равновесия в течение 30 мин.
2. По очереди отсоедините каждую выходную трубку и внесите 200 мкл каждого разбавления белка в выходной канал с помощью пипетки. Не давите, позвольте силе тяжести сделать свою работу. Отсоедините наконечник от пипетки и оставьте его прикрепленным к микрофлюидному устройству.
3. Повторите вышеуказанный шаг для каждого канала и убедитесь, что во время этого процесса в каналы не попадают пузырьки воздуха.
4. Опустите входную трубку на землю под микрофлюидным устройством, чтобы начать подачу белка по микроканалам. Прикрепите свободный конец трубки к контейнеру для отходов. Разбавляйте белки в течение 30 мин.<бр/> заметка: Это изменит поток вспять и позволит белку попасть в каналы. Время до уравновешивания и объем необходимых разведений белка будут зависеть от сродства взаимодействия.
5. На левой панели программного обеспечения, во вкладке «Таймлапс», нажмите «Старт», чтобы снова начать съемку.
6. Когда эксперимент будет завершен, сохраните файл замедленной съемки.

Результаты

Рисунок 1: Оценка целостности SLB и микроканалов. (A) Изображение, иллюстрирующее высококачественные SLB и микроканалы. (Б) Неполное сращение. (В) Предохранённые микроканалы. (D) Частицы пыли, захваченные в микроканале. (E) Пузырьки воздуха, захваченные в микроканалах.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин	Avanti Polar Lipids	850457К	ПОПК
L-α-фосфатидилинозитол-4-фосфат	Avanti Polar Lipids	840045Х	ПИ4П
L-α-фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат	Avanti Polar Lipids	840046Х	ПИ(4,5)П2
1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин	Avanti Polar Lipids	850757К	папа; Требуется для синтеза oSRB-POPE
Лиссамин родамин B сульфонилхлорид (смешанные изомеры)	ThermoFisher Scientific	Л-20	Требуется для синтеза oSRB-POPE
pH-чувствительный флуоресцентный липидный зонд (oSRB-POPE)	Внутри компании	Н/Д	Внутренний синтез (Huang D. et al. 2013)
Эпифлуоресцентный микроскоп Axiovert 200M	Микроскопия Carl Zeiss	Н/Д	микроскоп
Камера AxioCam MRm	Микроскопия Carl Zeiss	Н/Д	фотоаппарат
X-Cite 120	Excelitas Technologies	Н/Д	источник света
Набор фильтров Alexa 568	Микроскопия Carl Zeiss	Н/Д	Ex/Em 576/603 нм
Программное обеспечение AxioVision LE64 v.4.9.1.0	Микроскопия Carl Zeiss	Н/Д	Программное обеспечение для обработки изображений
Советы	ВВР	10034-132	наконечники для пипеток объемом 200 мкл; Тонкий и гладкий наконечник для введения белкового раствора в микрофлюидный канал
Советы	ВВР	53509-070	наконечники для пипеток объемом 10 мкл; Тонкий и гладкий наконечник для введения раствора везикулы в микрофлюидный канал
pH-метр Orion Star A321	Термо Сайентиал	STARA3210	pH-метр
Орион микро рН зонд	Термо Сайентиал	8220БНП	микродатчик pH
N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-(2-этанесульфоновая кислота)	ВВР	VWRB30487	HEPES, свободная кислота
Хлорид натрия	ВВР	BDH8014-2,5 кг	NaCl
трубопровод	Allied Wire & Cable	ТФТ-200-24 Н	Внутренний диаметр: 0,020-0,026 дюйма (0,051-0,066 см); Толщина стены: 0,010 дюйма (0,025 см); гибкая тонкостенная трубка из политетрафторэтилена; Натуральный цвет
Газообразный азот - промышленный	Праксаир	Н/Д	Местный поставщик услуг
Газообразный кислород - промышленный	Праксаир	Н/Д	Местный поставщик услуг
Жидкий азот	Праксаир	Н/Д	Местный поставщик услуг