Количественная внутриклеточная водородная ЯМР-спектроскопия для мониторинга белково-лигандных взаимодействий

Аннотация

Источник: Barbieri, L. et al., Мониторинг белково-лигандных взаимодействий в клетках человека с помощью количественного внутриклеточного ЯМР в реальном времени с использованием биореактора с высокой плотностью клеток.J. Vis. Exp.(2021)

В этом видео мы демонстрируем технику внутриклеточной спектроскопии ядерного магнитного резонанса для изучения белково-лигандных взаимодействий между немечеными сверхэкспрессированными белками и малыми молекулами. Успешное лиганд-белковое взаимодействие подтверждается визуально появлением дополнительного набора пиков в исследуемой спектральной области, который постепенно заменяет исходные пики.

Протокол

1. Настройка реагентов и растворов

1. Для приготовления полного DMEM добавьте 5 мл L-глутамина 200 мМ, 5 мл пенициллин-стрептомицина 100x и 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS, 10% об/об. конечной концентрации) в 440 мл DMEM.
   заметка: Этот раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 месяца.
2. Приготовьте раствор агарозы, растворив 150 мг агарозы с низким содержанием желирования в 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) при 85 °C до получения 1,5% (w/v) раствора. Стерилизовать путем фильтрации с помощью фильтра 0,22 мкм. Приготовьте 1 мл аликвот раствора агарозы в 1,5 Н
3. Подготовьте среду биореактора.
   1. Растворите 13,4 г порошка DMEM в 1 л сверхчистого H₂O.
      заметка: В зависимости от применения требуемый конечный объем может отличаться (например, для среды объемом 500 мл растворите 6,7 г порошка в 500 мл H₂O).
   2. Добавьте 2% FBS, 10 мМ NaHCO₃, 1x пенициллин-стрептомицин (100x) и 2%_D2O (например, для 500 мл среды добавьте 10 мл FBS, 0,4 г NaHCO₃, 5 мл пенициллин-стрептомицина 100x и 10 мл_D2O).
   3. Измерьте pH с помощью pH-метра и при необходимости отрегулируйте до 7,4, добавив HCl.
      заметка: Как правило, исходный pH очень близок к 7,4.
   4. Фильтруйте среду биореактора с помощью стерильного фильтра с вакуумным приводом в стерильной стеклянной бутылке объемом 250 мл или 500 мл.
   5. В колпаке с ламинарным потоком запечатайте флакон стерильным стальным наконечником с двумя насадками для шланга и подсоедините их к трубке FEP (наружный диаметр = 1/8", внутренний диаметр = 1,6 мм), которая будет подключена к насосу, и к шприцевому фильтру из ПТФЭ размером 0,22 μм для забора воздуха.

2. Настройка биореактора

1. Соберите проточный блок с помощью второй проточной ЯМР-трубки, которая позже будет заменена на ту, в которой находятся клетки. Обратитесь к инструкции по эксплуатации проточного агрегата для правильной сборки.
   заметка: К этому моменту проточный блок уже должен быть очищен (если нет, выполните шаг 4.2).
2. Установите водяную баню, подключенную к регулятору температуры проточного агрегата, на 37 °C. Поместите бутылку с резервуаром в водяную баню.
3. Подсоедините трубку FEP баллона с резервуаром к насосу.
4. Поверните клапан биореактора в положение «байпас» и предварительно заполните насос средой.
5. Поверните клапан биореактора в положение «поток» и предварительно заполните биореактор средой со скоростью 0,1 мл/мин.

3. Подготовка образца клетки

1. Соберите клетки из инкубатора с_СО2.
   1. Возьмите колбу Т75 с трансфицированными HEK293T клетками из инкубатора CO₂ и удалите отработанную среду.
   2. Дважды промойте ячейки 7 мл (каждая) PBS при комнатной температуре (~20 °C).
   3. Используйте 2 мл трипсина/ЭДТА для отделения клеток. После добавления раствора инкубировать 5 мин при комнатной температуре для отделения клеток.
      заметка: Трансфицированным клеткам может потребоваться немного больше времени для отслоения. При необходимости инкубируйте клетки при температуре 37 °C.
   4. Инактивируйте трипсин с помощью 20 мл полного DMEM; тщательно ресуспендируйте клетки путем пипетирования вверх и вниз и переноса их в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
   5. Центрифугируйте клетки при давлении 800 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
   6. Промойте ячейки 10 мл PBS при комнатной температуре, чтобы удалить остатки среды.
   7. Центрифугируйте клетки при давлении 800 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
   8. Переложите клеточную гранулу в микроцентрифужную пробирку с крышкой объемом 1,5 мл.
2. Заложите ячейки в агарозные нити.
   1. Растопите одну аликвоту затвердевшей агарозы при 85 °C на водяной бане и затем выдержите ее в растворе при температуре 37 °C в блочном нагревателе.
   2. С помощью пипетки Пастера заполните дно проточной ЯМР-трубки 60-70 мкл 1,5% агарозного геля и поместите его в лед. Это создаст нижнюю пробку высотой ~5 мм, которая позволит поместить образец клетки в активный объем катушки ЯМР 1 H.
   3. Полученную на шаге 3.1.8 гранулу элементов нагревать при 37 °С в течение 15−20 с в термоблоке.
   4. Ресуспендируйте клетки в 450 мкл раствора агарозы. Будьте внимательны, чтобы не допустить образования пузырьков.
   5. Аспирируйте клеточную агарозную суспензию в хроматографическую трубку PEEK длиной ~30 см (id. = 0,75 мм), соединенную со шприцем объемом 1 мл.
      заметка: Перед аспирацией трубка и мертвый объем шприца должны быть предварительно заполнены PBS при комнатной температуре, чтобы избежать образования пузырьков. Длина трубки не имеет решающего значения.
   6. Дайте трубке остыть при комнатной температуре в течение 2 минут.
   7. Предварительно заполните проточную проточную трубку ЯМР 100 мкл PBS при комнатной температуре.
   8. Отлите нити клеток, встроенных в агарозу, в проточную ЯМР-трубку, осторожно надавливая на шприц.
      заметка: Чтобы равномерно заполнить ЯМР-трубку, начните с помещения конца трубки PEEK в нижнюю часть ЯМР-трубки и двигайтесь к верху, медленно раскачиваясь влево-вправо.
   9. Повторяйте шаги 3.2.5, 3.2.6 и 3.2.8 до тех пор, пока вся клеточная агарозная суспензия не будет отлита.
3. Вставьте клетки в биореактор.
   1. Извлеките пустую трубку ЯМР из проточного устройства и увеличьте расход до 2 мл/мин на несколько минут, чтобы удалить остаточные пузырьки газа на входной трубке.
   2. Установите скорость потока на 0,2 мл/мин и вставьте ЯМР-трубку, содержащую клетки, медленно, но неуклонно проталкивая ее вверх.
      заметка: Активный поток среды позволяет избежать обратного потока содержимого пробирки через входное отверстие, который в противном случае мог бы произойти во время введения.

4. Эксплуатация и очистка биореактора

1. Работа биореактора во время эксперимента ЯМР.
   1. Установите температуру в ЯМР-спектрометре на 310 К.
   2. Вставьте блок расхода в спектрометр.
   3. Подавать среду биореактора со скоростью потока 0,1 мл/мин в течение всего времени проведения внутриклеточных ЯМР-экспериментов.
   4. В нужное время эксперимента ввести концентрированный раствор внешней молекулы в бутылку со средним резервуаром, проткнув силиконовую трубку стерильным длинноигольчатым шприцем. <бр/> заметка: Окончательная концентрация молекулы в среде должна быть выбрана на основе предварительных знаний о клеточной токсичности и, если таковые имеются, на прогнозируемой/расчетной скорости диффузии через клеточную мембрану.
   5. В конце эксперимента ЯМР замените трубку с клетками на пустую трубку и промойте проточный блок водой.
2. Безразборная очистка биореактора.
   1. Очистите проточную установку путем подачи следующих растворов со скоростью 1 мл/мин: 0,2 М гидроксида натрия (NaOH); 3 М лимонной кислоты; 0,2 М NaOH в течение не менее 30 мин каждый, а затем стерильно отфильтрованной сверхчистой воды в течение >2 ч.
   2. Очищайте и автоклавируйте баллон резервуара и трубки в сборе после каждого запуска.

5. Эксперименты с ЯМР

1. Постановка экспериментов ЯМР.
   заметка: Выполните эти шаги заранее, до подготовки образца ЯМР в клетке, чтобы избежать задержек между сбором клеток и получением данных.
   1. Создайте новый набор данных на ЯМР-спектрометре и задайте параметры для нужных ЯМР-экспериментов.
   2. Задайте параметры для экспериментов 1D ¹H NMR.
   3. Центрируйте несущую частоту ¹H на уровне 4,7 ppm на сигнале воды.
   4. Выберите программу импульсов zgesgp, установите спектральную ширину 20 ppm и прямоугольный импульс 1 000 мкс 180° для подавления воды. Установите задержку между сканированиями 1 с. Получите спектр с помощью 32 сканирований.
   5. Для ячеек, экспрессирующих немеченый CA II: выберите программу импульсов p3919gp, установите спектральную ширину на 30 ppm, чтобы покрыть иминообласть спектра, и отрегулируйте задержку для биномиального подавления воды таким образом, чтобы максимальное возбуждение было сосредоточено на химических сдвигах интересующих сигналов (d7 = 20 мкс на частоте 950 МГц). Установите задержку между сканированиями в ≥1 с. Получение данных с помощью 512 сканов.
   6. Для ячеек, экспрессирующих ¹⁵N-меченых SOD1: выберите импульсную программу sfhmqf3gpph, установите спектральную ширину ¹H и ¹⁵N равной 16 и 50 ppm соответственно, смещение сформированного импульса и ширину полосы возбуждения равную 8,5 и 6 ppm соответственно, и импульс 350 мкс для схемы развязки (garp4 или другую в зависимости от прибора). Установите задержку между сканированиями 0,3 с. Получение 16 сканов и 128 приращений в измерении ¹⁵Н.
2. Получение спектров ЯМР в режиме реального времени.
   1. После того, как биореактор вставлен в ЯМР-спектрометр, подождите несколько минут, чтобы дать возможность сменить среду.
      заметка: Этот процесс легко отслеживается по появлению сигнала блокировки, так как PBS заменяется на среду, содержащую 2% D₂O.
   2. Отрегулируйте согласование и настройку канала ¹H, установите прокладку магнита и рассчитайте длину жесткого импульса ¹H 90°.
   3. Отрегулируйте уровни мощности ¹H в каждой последовательности импульсов в соответствии с жестким импульсом ¹H.
   4. Запишите первый спектр zgesgp ¹H, чтобы проверить содержимое образца и однородность поля.
   5. Скопируйте эксперименты zgesgp и p3919gp/sfhmqcf3gpph на нужное число и поставьте их в очередь в очереди сбора.
      центр сертификации: Спектры zgesgp используются только для контроля состояния образца и однородности поля; Поэтому их можно либо пропустить, либо записывать реже.
   6. Для клеток, экспрессирующих немеченый CA II: обрабатывайте спектры p3919gp с применением функции нулевого заполнения и экспоненциального расширения линии (LB = 20 Гц).
   7. Для клеток, экспрессирующих ¹⁵N-меченых SOD1: обрабатывайте спектры sfhmqcf3gpph путем применения нулевого заполнения и квадратной функции синусоидального окна (SSB = 2) в обоих измерениях.
      заметка: Размер обрабатываемых спектров может быть дополнительно уменьшен за счет удаления областей, свободных от сигналов (в Topspin это делается путем установки нужных значений STSR и STSI).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
материалы
лимонная кислота	Сигма-Олдрич	251275
D2O	Сигма-Олдрич	453366
ДМЭМ, высокий уровень глюкозы	Технологии Life	10313-021
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, порошок	Сигма-Олдрич	Д5648
ФБС	Технологии Life	10270
список совместимого оборудования	Сигма-Олдрич	No 30721
L-глютамин (200 мМ)	Технологии Life	No 25030
Низкожелирующая агароза, пудра	Сигма-Олдрич	А4018
NaHCO3, порошок	Карло Эрба	478537
ПБС	Технологии Life	10010
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)	Технологии Life	15140-122
Пеллеты NaOH	Сигма-Олдрич	No 30620 (Английский
Трипсин-ЭДТА (0,05% (масс./об.))	Технологии Life	No 25300-054
оборудование
Спектрометр Avance III с 5 мм криозондом	Брукер	н/д	Совместимы все современные спектрометры и узкопроходные магниты, оснащенные 5-миллиметровыми щупами.
Проточная единица InsightMR	Брукер	н/д
Насосный модуль P-920 от ÄKTA FPLC	GE Healthcare	н/д	Любой перистальтический или шприцевой насос FPLC, ВЭЖХ должен быть совместим с проточным устройством.

шт. )