$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведены шаги для скрининга распознавающих лекарства Т7-фагов с помощью биосенсора QCM и восстановления скрининговых фагов через инфекцию E. coli (BLT5615). Протоколы синтеза производного малой молекулы, образующей самоорганизующийся монослой (SAM), и построения библиотеки 15-мерных случайных пептидов на фаговом дисплее T7 можно найти в других источниках.
1. Подготовка чипа датчика QCM
- Прикрепите керамический сенсорный чип к генератору аппарата QCM с частотой 27 МГц и зарегистрируйте собственную частоту (Гц) в воздушной фазе перед иммобилизацией малых молекул.
- Отсоедините микросхему и капните 20 мкл раствора (1 мМ в 70% этаноле) низкомолекулярного производного, образующего SAM, на золотой электрод сенсорного чипа с помощью пипетки.
осторожность: Кристалл чипа датчика, в котором расположен золотой электрод (Au, толщина 0,1 мм, внутренний диаметр 2,5 мм, диаметр 4,9мм2), очень тонкий и может легко трескаться (SiO2, толщина 0,06 мм, внутренний диаметр 9 мм). Следовательно, осторожно пипеткайте.
- Оставьте на 1 час при комнатной температуре (около 20 °C) в чашке Петри с увлажненной тканью и защищенной от комнатного освещения.
- Аккуратно промойте поверхность электрода сверхчистой водой, затем удалите капли воды, продувая воздухом с помощью шприца или воздушной тряпки.
- Настройте чип датчика для аппарата QCM и запишите снижение частоты в воздушной фазе, чтобы измерить количество иммобилизованной малой молекул><ы.
заметка: Для успешной иммобилизации малых молекул необходимо не менее 100 Гц собственной частоты (1 Гц иммобилизует 30 пг).
2. Биопанорамирование библиотеки фагов Т7 с использованием биосенсора QCM (Рисунок 1)
- Установите кювету со специальной магнитной мешалкой на биосенсор QCM и влейте в кювету 8 мл реакционного буфера (10 мМ Tris-HCl, 200 мМ NaCl, pH 7-8).
- Присоедините микросхему датчика QCM к генератору и потяните вниз рычаг генератора, чтобы погрузить микросхему в буфер, перемешиваемый со скоростью 1000 об/мин.
- Начните контролировать частоту QCM на персональном компьютере (ПК) и подождите, пока сенсорная грамма уравновесится примерно на 3 Гц/мин от дрейфа частоты.
- Введите 8 мкл фаговой библиотеки Т7 (1—2 ×10 10 БОЕ/мл) в кювету (конечная концентрация: 1—2 × 107 БОЕ/мл) и отметьте точку инъекции на сенсоре.
- В течение 10 мин наблюдайте за снижением частоты, вызванным связыванием Т7-фагов с малой молекулой, иммобилизованной на поверхности золотого электрода.
- Остановите частотный монитор QCM, отсоедините микросхему датчика от генератора и снимите буфер, продув воздух и/или запачкав салфетками.
- Поместите сенсорный чип во влажную чашку Петри и капните 20 мкл суспензии E. coli (BLT5615) (OD600 = 0,5—1,0 после встряхивания при 37 °C путем добавления IPTG до 1 мМ) клеток-хозяев в логарифмической фазе на золотой электрод.
- Закройте крышку посуды и накройте ее алюминиевой фольгой, чтобы заблокировать свет.
- Инкубируйте чашку при 37 °C в течение 30 минут на 96-луночном микропланшетном смесителе (1000-1500 об/мин) для улучшения восстановления связанных Т7 фагов.
- Восстановите 20 мкл раствора и суспензируйте его в 200 мкл LB среды.
заметка: Образцы, полученные на этом этапе, могут храниться при температуре 4 °C в течение одной недели.
- Приготовьте серию разведения фагового раствора для выделения бляшек и секвенирования ДНК по общей процедуре, описанной в инструкции производителя.
