$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка системы
- Подключите детекторы MALS и dRI после УФ-детектора FPLC. Обходите стороной детекторы pH и проводимости, так как они значительно увеличивают междетекторный объем между УФ- и MALS-детекторами. Используйте капиллярные трубки с внутренним диаметром 0,25 мм от колонны к детекторам и между детекторами и капиллярные трубки с внутренним диаметром 0,75 мм на выходе детекторов в сборник отходов или фракций.
- Убедитесь, что установлены необходимые сигнальные соединения между FPLC и детекторами, включая аналоговый выход от УФ-детектора к аналоговому входу MALS и цифровой выход от FPLC к автоинжектору MALS через блок ввода-вывода FPLC.
- Установите подходящую аналитическую колонку SEC, охватывающую диапазон фракционирования от 20 кДа до 500 кДа. Проверьте информацию о продукте, чтобы определить, подходит ли колонка для диапазона СВт, pH и других свойств образца и подвижной фазы.
2. Подготовка буфера, промывка системы на ночь и проверка чистоты
- Используя реагенты класса ВЭЖХ, приготовьте 1 л фосфатно-солевого буфера с 50-100 мМ NaCl. Отфильтруйте буфер до 0,1 мкм с помощью полиэфирсульфонового фильтра на крышке бутылки или аналогичного фильтра. Отфильтруйте первые 50-100 мл буфера в бутылку для отходов и выбросьте, чтобы удалить частицы из сухих фильтров, а затем отфильтруйте оставшуюся часть в чистую, стерильную бутылку, которая была тщательно вымыта фильтрованной, деионизированной водой и закрыта крышкой для предотвращения попадания пыли><.
заметка: Другие растворители в подвижной фазе, такие как трис-буфер, могут быть использованы, если необходимо проанализировать дополнительные белки, которые преимущественно растворены в этих растворителях.
- Промывайте в течение ночи со скоростью потока 0,5 мл/мин или в соответствии с другими рекомендациями производителя колонки, чтобы уравновесить колонку в буфере и удалить твердые частицы. Используйте режим непрерывного потока FPLC и убедитесь, что поток не останавливается до тех пор, пока не будут завершены все прогоны SEC-MALS.
- Поместите проточную ячейку dRI в режим продувки во время ночной промывки. Выключите продувку перед началом прогонов проб.
- Начиная промывку, постепенно увеличивайте расход, чтобы предотвратить эффект «осыпания колонны» (или выброс частиц), вызванный резким изменением давления в колонне.
- Если известно, что система достаточно стабильна и не содержит частиц, а также находится в равновесии с желаемой подвижной фазой, замените ночную промывку на более короткую, 2-3 часа.
- Проверьте чистоту системы, слегка постучав по трубке ниже по потоку от колонки, чтобы выпустить накопленные частицы, и наблюдая за сигналом детектора под углом 90° на дисплее на передней панели прибора MALS. Убедитесь, что размах шума не превышает 50 -100 мкВ.
- Выполните «холостой» впрыск, чтобы убедиться, что инжектор чист от частиц. «Холостой» — это просто работающий буфер, приготовленный в свежем стерильном флаконе.
- Если пик частиц составляет не более 1 мл по объему и не более чем на 5 мВ выше исходного уровня, то система готова к отбору проб. В противном случае выполните дополнительные холостые инъекции до очистки или выполните техническое обслуживание для очистки инжектора.
3. Подготовка и загрузка образца
- Приготовьте не менее 200 мкл БСА в концентрации 1-2 мг/мл в буфере SEC.<бр/>
заметка: Во избежание выпадения осадков БСА никогда не следует растворять в чистой воде.
- Отфильтруйте белок до 0,02 мкм с помощью фильтра с наконечником шприца.
- Выбросьте первые несколько капель фильтрата, чтобы удалить частицы из сухих фильтров.
- В качестве альтернативы можно центрифугировать образец при давлении 10 000 x g в течение 15 минут, чтобы обеспечить осаждение нерастворимых агрегатов и других крупных частиц.
- Введите в петлю 100 μL раствора BSA.
заметка: Это рекомендуемое количество материала, которое может быть введено в большее или меньшее количество в зависимости от обстоятельств образца, таких как стабильность или доступность. Количество белка, необходимое для инъекции, изменяется обратно пропорционально молекулярной массе, в два раза больше требуется белковой массы, если молекулярная масса составляет 33 кДа или вдвое меньше, чем у BSA.
4. Подготовка программного обеспечения MALS
- Открыть новый | Экспериментируйте в разделе Метод в меню программного обеспечения MALS и выберите метод Онлайн в папке методов системы Рассеяние света. Если детектор DLS присутствует, выберите метод Онлайн из меню Рассеяние света | С папкой QELS.
- В разделе Конфигурация задайте параметры выборочной и мобильной фазы.
- В окне Generic Pump (Общий насос) установите расход на тот, который используется в FPLC.
- В представлении Универсальный насос, ветвь Растворитель, поле Имя выберите PBS.
- В представлении Injector, Sample branch введите Name как BSA и установите dn/dc = 0,185 (стандартное значение для немодифицированных белков), A2 = 0 и коэффициент угасания ультрафиолетового излучения = 0,667 мл/(мг-см).
заметка: Для других белков коэффициент экстинкции UV280 нм можно найти в литературе или рассчитать по его последовательности с помощью различных общедоступных программных инструментов.
- В разделе "Процедуры" в окне "Базовая коллекция" установите флажок "Триггер при автоинъекции" и установите продолжительность прогона равной 70 минутам, чтобы данные собирались для всего элюирования до тех пор, пока не будет достигнут общий объем проникновения столбца SEC.
заметка: Необходимое время может варьироваться в зависимости от колонки и расхода - 35 минут сбора требуется для стандартной колонки 7,8 мм x 300 мм HPLC-SEC со скоростью 0,5 мл/мин.
- Запустите эксперимент в программном обеспечении MALS, нажав кнопку «Выполнить». Он начнет считывать данные после получения импульсного сигнала от прибора FPLC через детектор MALS.
- Обнулите сигнал dRI, нажав кнопку «Автообнуление» на передней панели прибора.
5. Подготовка программного обеспечения FPLC
- Введите название белка и прогон в программном обеспечении FPLC, в Manual | Выполнение инструкций вручную | Установите отметку.
- Переключение клапана впрыска с ручной нагрузки на впрыск под траекторией потока | Клапан впрыска.
- Включение импульсного сигнала путем вставки импульса 0,5 с под блок ввода-вывода | Импульсный цифровой выход. Это приведет к сбору данных в программном обеспечении MALS.
6. Вставьте образец в цикл. Нажмите кнопку «Выполнить» в программном обеспечении FPLC, чтобы начать выполнение эксперимента.