Method Article

Бимолекулярная комплементация, аффинная очистка для выделения двух взаимодействующих белков

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Hastings, J. F. et al. Рассечение мультибелковых сигнальных комплексов с помощью бимолекулярной комплементационной аффинной очистки (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы продемонстрировали бимолекулярную комплементационную аффинную очистку, BiCAP, для обнаружения и выделения специфических белковых димеров с использованием конформационно-специфичных однодоменных антител.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Клеточная культура и трансфекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансфекции векторов BiFC важно достичь высокой эффективности и относительно однородной трансфекции. Векторы, вероятно, будут совместимы с любым стандартным реагентом для трансфекции, и условия трансфекции должны быть соответствующим образом оптимизированы. Для выполнения масс-спектрометрии мы обычно культивируем клетки в пределах 10-сантиметровых чашек, хотя это также может быть пропорционально уменьшено до меньших чашек или планшетов для экспериментов, требующих меньшего количества материала.

  1. Семена 1,0 × 106 HEK293T клеток в чашк....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMGibco11995-073Культура клеток
ФБСКомпания «Лайф Текнолоджис Австралия»10099-141Культура клеток
Пенициллин/стрептомицинКомпания «Лайф Текнолоджис Австралия»15070-063Культура клеток
Буфер для трансфекции jetPRIMEПолиплюс114-15Культура клеток
Реагент для трансфекции jetPRIMEПолиплюс114-15Культура клеток
ФосСТОП (ингибитор фосфатазы)Сигма-Олдрич4906837001Культура клеток
Комплексный, мини, коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТАРош11873580001Пластиковая посуда
Скребок для ячеекСарштедт83.1832
ГФП-Trap_AChromotek GmbhГТА-100Нанотело GFP в сочетании с шариками агарозы
N-концевое моноклональное антитело GFPКовансММС-118ПОбнаружит тег V1 в векторах BiFC
С-концевое моноклональное антитело GFPРош11814460001Обнаружит тег V2 в векторах BiFC
Буфер для образцовИнвитрогенНП0008Дополнен 1 мл β-меркаптоэтанола.
Секвенирование модифицированного трипсинаКорпорация PromegaV5117hКультура клеток
Микроцентрифужные пробирки LoBindДиагностика на месте оказания медицинской помощи0030 108 116 (АнглийскийПластиковая посуда
ЙодоацетамидСигма-ОлдричИ1149-5ГПриготовлен из расчета 5 мг/мл в ультрачистой воде
LTQ Orbitrap Velos ProТермо Фишер
Клетки DH5αТермо ФишерЭлементы, устойчивые к тепловому удару
)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bimolecular ComplementationAffinity PurificationProtein Interaction DetectionFluorescence MicroscopyAgarose BeadsWestern BlottingSDS PAGECell LysisTransfection ReagentHEK293T Cells

Related Articles