Бимолекулярная комплементация, аффинная очистка для выделения двух взаимодействующих белков

Аннотация

Источник: Hastings, J. F. et al. Рассечение мультибелковых сигнальных комплексов с помощью бимолекулярной комплементационной аффинной очистки (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы продемонстрировали бимолекулярную комплементационную аффинную очистку, BiCAP, для обнаружения и выделения специфических белковых димеров с использованием конформационно-специфичных однодоменных антител.

Протокол

1. Клеточная культура и трансфекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансфекции векторов BiFC важно достичь высокой эффективности и относительно однородной трансфекции. Векторы, вероятно, будут совместимы с любым стандартным реагентом для трансфекции, и условия трансфекции должны быть соответствующим образом оптимизированы. Для выполнения масс-спектрометрии мы обычно культивируем клетки в пределах 10-сантиметровых чашек, хотя это также может быть пропорционально уменьшено до меньших чашек или планшетов для экспериментов, требующих меньшего количества материала.

1. Семена 1,0 × 10⁶ HEK293T клеток в чашке 10 см с 10 мл среды DMEM, дополненной 10% FBS и пенициллином/стрептомицином (1:100).
2. Разбавьте 2,5 мкг каждого вектора BiFC в 500 мкл буфера для трансфекции (см. Таблицу материалов) в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.
3. Добавьте 10 мкл реагента для трансфекции (см. Таблицу материалов).
4. Вихревую смесь в течение 10 с, затем кратковременно центрифугировать. Выдерживать 10 минут при комнатной температуре.
5. Добавьте смесь для трансфекции ДНК в планшет по каплям. Инкубируйте клетки в течение достаточного периода времени для взаимодействия белков слияния BiFC, а также для сворачивания Венеры и созревания флуорофора, обычно ~8 - 24 h.
   Примечание: Пиковое возбуждение для Венеры составляет 515 нм, а пиковое излучение — 528 нм, хотя это легко увидеть с помощью стандартного флуоресцентного микроскопа, настроенного на визуализацию флуоресценции GFP.

2. Подготовка образцов

1. Заготовка лизатов
   1. Перед сбором лизата приготовьте буфер для лизиса клеток [50 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% (v/v) неионогенного детергента (см. Таблицу материалов)]. Хранить при температуре 4 °C.
   2. Непосредственно перед забором добавьте 10 мл буфера для лизиса клеток с ингибитором протеазы и ингибитором фосфатазы (см. Таблицу материалов). Держите на льду дополнительный буфер для лизиса клеток.
   3. Дважды промойте клетки в ледяном PBS. Аспирируйте PBS и добавьте 1 мл буфера для лизиса клеток с ледяной добавкой. Поставьте тарелку на лед, убедившись, что буфер распределен по всей площади поверхности.
   4. Инкубируйте на льду в течение примерно 5 минут, затем с помощью скребка для клеток (см. Таблицу материалов) соскребите клетки и перенесите их в предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
   5. Удалите клеточный мусор путем центрифугирования собранного лизата при 18 000 × г в течение 5 минут при 4 °C и перелейте очищенную надосадочную жидкость в свежие микроцентрифужные пробирки><. заметка: На этом этапе лизат можно использовать немедленно или хранить при температуре -80 °C. Также рекомендуется хранить аликвоту сырого лизата, чтобы можно было проверить эффективность трансфекции и аффинной очистки.
2. Аффинная очистка
   заметка: Этап выделения BiCAP выполняется с использованием нанотела GFP, сопряженного с шариками агарозы (см. таблицу материалов).
   1. Приготовьте шарики агарозы, промыв соответствующий объем (20 μL на образец + 10 μL избыток) в 1 мл PBS. Центрифугируйте шарики при 300 х г и удалите надосадочную жидкость.
   2. Добавьте 20 μL в каждый образец лизата.
   3. Образцы инкубировать в течение 2 ч при 4 °C с вращением встык.
      заметка: На этом этапе образцы могут быть подготовлены либо для SDS-PAGE и вестерн-блоттинга, либо для анализа с помощью масс-спектрометрии.
3. Приготовление элюента BiCAP для вестерн-блоттинга.
   1. Центрифугируйте шарики при давлении 300 x g и трижды промойте их в буфере для лизиса клеток.
   2. Суспендируйте промытые шарики в 50 мкл соответствующим образом разбавленного буфера для образцов (см. Таблицу материалов) и нагрейте образцы при температуре 95 °C в течение 2-3 мин.<бр/> заметка: Приготовленные таким образом образцы могут храниться при температуре -20 °C в течение нескольких месяцев.
   3. Выполните SDS-PAGE и вестерн-блоттинг для меток V1 и V2 (см. Таблицу материалов), а также для любых других белков, представляющих интерес.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM	Gibco	11995-073	Культура клеток
ФБС	Компания «Лайф Текнолоджис Австралия»	10099-141	Культура клеток
Пенициллин/стрептомицин	Компания «Лайф Текнолоджис Австралия»	15070-063	Культура клеток
Буфер для трансфекции jetPRIME	Полиплюс	114-15	Культура клеток
Реагент для трансфекции jetPRIME	Полиплюс	114-15	Культура клеток
ФосСТОП (ингибитор фосфатазы)	Сигма-Олдрич	4906837001	Культура клеток
Комплексный, мини, коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА	Рош	11873580001	Пластиковая посуда
Скребок для ячеек	Сарштедт	83.1832
ГФП-Trap_A	Chromotek Gmbh	ГТА-100	Нанотело GFP в сочетании с шариками агарозы
N-концевое моноклональное антитело GFP	Кованс	ММС-118П	Обнаружит тег V1 в векторах BiFC
С-концевое моноклональное антитело GFP	Рош	11814460001	Обнаружит тег V2 в векторах BiFC
Буфер для образцов	Инвитроген	НП0008	Дополнен 1 мл β-меркаптоэтанола.
Секвенирование модифицированного трипсина	Корпорация Promega	V5117h	Культура клеток
Микроцентрифужные пробирки LoBind	Диагностика на месте оказания медицинской помощи	0030 108 116 (Английский	Пластиковая посуда
Йодоацетамид	Сигма-Олдрич	И1149-5Г	Приготовлен из расчета 5 мг/мл в ультрачистой воде
LTQ Orbitrap Velos Pro	Термо Фишер
Клетки DH5α	Термо Фишер		Элементы, устойчивые к тепловому удару

)