1. Подготовка образцов
- Очистите нужную биомолекулу.
заметка: В этом протоколе используется приобретенный кокаин-связывающий ДНК-аптамер MN4 после трехкратного обмена с 2 M NaCl с последующим тремя раундами деионизированной воды с использованием центробежного фильтра с отсечкой молекулярной массы 3 кДа.
- Синтезируйте и очистите, или приобретите желаемый термолабильный лиганд.
заметка: MN4 связывается с термолабильным лигандом кокаина. MN4 также связывается с хинином, который используется в качестве отрицательного контроля термолабильности лиганда при этих экспериментальных температурах.
- Приготовьте буферы для диализа очищенной биомолекулы и растворения лигандов (20 мМ фосфата натрия и 140 мМ буфера NaCl, pH 7,4, для MN4 и используемых здесь лигандов).
- Биомолекулу диализируют относительно не менее 2 л буфера с помощью диализной трубки с отсечкой 0,5 - 1,0 кДа.
- Отфильтруйте конечный буфер (называемый рабочим буфером) через фильтр 0,2 мкм, который был тщательно сбалансирован с буфером.
- Взвесьте нужные массы лигандов и растворите их в отфильтрованном рабочем буфере. Если для желаемой концентрации лиганда требуются массы, которые слишком малы для точного взвешивания, сделайте концентрированный исходный раствор лиганда (например, в 10 раз).
заметка: Крайне важно, чтобы во всех экспериментах с ДСК использовался один и тот же рабочий буфер для образца и лиганда, т.е. никогда не проводите эксперимент, в котором лиганд растворяется в другой партии рабочего буфера, чем биомолекула, поскольку это приведет к артефактам несоответствия буфера в данных.
- Отфильтруйте стоковый раствор биомолекулы через фильтр 0,2 мкм, который был тщательно сбалансирован с рабочим буфером.
- Определите концентрацию биомолекул с помощью измерений абсорбции (260 нм для нуклеиновых кислот, таких как MN4, и 280 нм для белков).
- Приготовленную биомолекулу и лиганд хранят в холодильнике при температуре 4 °C (подходит для MN4 и используемых здесь лигандов) или при -20 или -80 °C, если биомолекула и лиганды хорошо переносят замораживание и требуется длительное хранение. Дегазируйте растворы буфера, биомолекулы и лиганда в настольном дегазаторе (см. Таблицу материалов) перед загрузкой в DSC.
заметка: Дегазация помогает предотвратить образование пузырьков в ДСК при более высоких температурах. Пузырьки вызывают артефакты сигнала, которые скрывают форму пиков и базовые линии DSC.
2. Подготовка к DSC
- Открутите прижимную ручку от ДСК (см. Таблицу материалов).
- Проложите силиконовую трубку от рабочего буфера и прикрепите ее к переднему фланцу (металлическому отверстию) эталонного капилляра.
- Создайте мост между эталонным и образцом капилляров, присоединив задний опорный фланец к переднему фланцу образца.
- Прикрепите кусок силиконовой трубки к заднему фланцу для образца, который идет к колбе для отходов с подключенной вакуумной линией.
- Включите вакуумную линию, чтобы промыть ДСК 200 мл рабочего буфера.
- Загрузите опорный капилляр ДСК с рабочим буфером. Прикрепите примерно 3-5 см секций силиконовой трубки к контрольным капиллярным фланцам.
- Вставьте наконечник для дозатора объемом 1 мл в силиконовую трубку заднего фланца. Наберите 0,8 мл рабочего буфера с помощью пипетки и вставьте наконечник пипетки с буфером в силиконовую трубку переднего опорного фланца.
- Осторожно нажмите на поршень пипетки, чтобы пропустить рабочий буфер через переднюю силиконовую трубку в контрольный капилляр и вверх в прикрепленный наконечник пипетки заднего фланца. Нажмите на поршень пипетки до тех пор, пока уровень рабочего буфера не достигнет чуть выше передней силиконовой трубки, затем отпустите поршень пипетки, пока уровень рабочего буфера не достигнет чуть выше задней силиконовой трубки.
- Повторите прохождение рабочего буфера вперед и назад, чтобы продуть объем в опорном капилляре пузырьков.
заметка: Обычно достаточно 10 проходов раствора туда и обратно, чтобы очистить любые пузырьки.
- Закройте задний наконечник пипетки большим пальцем и осторожно потяните вверх задний наконечник пипетки и передний пипетку, чтобы снять их с контрольных фланцев с прикрепленной силиконовой трубкой.
- Загрузите капилляр образца с рабочим буфером, как показано на шагах 2.6 - 2.9. Установите черный пластиковый колпачок на задний контрольный фланец и фланец образца, оставив передние фланцы открытыми.
- Прикрепите прижимную ручку.
- Откройте программное обеспечение DSC (см. Таблицу материалов) и нагнетайте давление в приборе><, нажав на красную стрелку вверх в верхней части интерфейса, как только показания мощности стабилизируются; мощность DSC отображается в поле в правом верхнем углу интерфейса вместе с показаниями температуры и давления прибора.
заметка: Следите за показаниями мощности при нагнетании давления в ЦИВ. Изменения мощности более чем на ~10 мкВт указывают на образование пузырьков в капиллярах, что может вызвать артефакты в данных. Перед продолжением работы растворы должны быть удалены и дегазированы.
- Уравновесьте ДСК с рабочим буфером, выполнив прямое и обратное сканирование. На вкладке "Экспериментальный метод" в левой части экрана убедитесь, что выбрана опция "Сканирование" для запуска DSC в режиме сканирования температуры.
заметка: Экспериментальными параметрами являются температурный диапазон сканирования, скорость сканирования, время равновесия низких и высоких температур, а также количество сканирований.
- Во вкладке «Температурные параметры» на вкладке «Экспериментальный метод» нажмите кнопку «Нагрев». Введите 1 и 100 °C для нижней и верхней экспериментальных температур, 1 °C/мин для скорости сканирования и 60 с для периода равновесия.
- Нажмите кнопку «Добавить ряд» под полем ввода для периода уравновешивания . Введите 2 в поле «Шаги для добавления» во всплывающем окне (для одного сканирования нагрева и одного сканирования охлаждения) и поставьте галочку в поле «Альтернативное отопление/охлаждение». Нажмите «ОК»; Добавленные сканы появятся в нижней части интерфейса. Убедитесь, что параметры для каждого сканирования соответствуют желаемым.
- Начните эксперимент, нажав зеленую кнопку «Играть» в верхней части интерфейса. Перейдите в нужную папку и введите имя файла для сохранения эксперимента во всплывающем окне. Чтобы посмотреть ход выполнения эксперимента, нажмите на вкладку «Данные» справа от вкладки «Метод эксперимента».
3. Сбор наборов данных термолабильного лиганда DSC
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная процедура состоит из пяти экспериментов: эксперименты с буфером с лигандом и без него (используемые для вычитания исходного уровня), эксперименты с образцами со свободной биомолекулой, связанной с лигандом биомолекулой и связанной с лигандом биомолекулой с более длительным периодом высокотемпературного равновесия.
- Выполните эталонные эксперименты для вычитания исходных данных из образца данных. Перезагрузите ДСК с рабочим буфером в обоих капиллярах и соберите несколько прямых и обратных сканирований в подходящем диапазоне температур при 1 °C мин-1 с верхним (высокотемпературным) временем уравновешивания 120 с.
- Удалите предыдущие сканирования балансировки буфера в нижней части интерфейса, выделив каждое из них по отдельности и щелкнув красный крестик в середине правого угла интерфейса. Добавьте новые сканы, нажав кнопку «Добавить серию», введя 20 в поле «Шаги для добавления» и установив флажок «Альтернативное отопление/охлаждение». Нажмите OK и запустите эксперимент, нажав зеленую кнопку воспроизведения, как указано выше.
- Повторите шаги 3.1 - 3.1.1 с рабочим буфером, содержащим желаемую концентрацию лиганда в обоих капиллярах, чтобы получить контрольные эксперименты для лиганда (соберите два отдельных эксперимента с использованием времени высокотемпературного равновесия соответственно 120 с и 600 с, которые будут использованы для получения константы скорости для термолабильного преобразования лиганда).
заметка: Используемая здесь скорость сканирования гарантирует, что биомолекула в последующих экспериментах находится в тепловом равновесии при прямом и обратном сканировании. Скорости сканирования < 0,1 - 0,2 °C min-1 приводят к зашумленным термограммам и не применимы в экспериментах ДСК. Эти температуры должны варьироваться от значительно ниже температуры плавления свободной биомолекулы до значительно выше температуры плавления биомолекулы, насыщенной лигандом (~ 20 - 80 °C для MN4). Проверьте воспроизводимость сканирований (например, достаточно 10 прямых и 10 обратных сканирований для всего 20).
- При использовании нескольких лигандов (таких как кокаин и хинин) промывайте ДСК 200 мл рабочего буфера (повторите шаг 2.5) между прогонами, чтобы удалить лиганды из капилляров и предотвратить перекрестное загрязнение><.
заметка: Полезно провести повторный эксперимент на свободной биомолекуле после лиганд-связанного прогона, чтобы проверить, сильно ли предыдущий лиганд адсорбируется к стенкам капилляров и не удаляется ли он адекватно с помощью буферной промывки. Если после эксперимента, связанного с лигандом, термограммы для свободной биомолекулы смещаются в сторону большей величины и более высокой температуры денатурации, то вполне вероятно, что предыдущий лиганд все еще присутствует в калориметре после промывки. Удалите адсорбированный лиганд путем инкубации капилляров с 20% Contrad-70 в течение 1 ч при 60 °C при снятых пластиковых колпачках и напорной ручке. В программном обеспечении DSC измените режим эксперимента на «Изотермический» на вкладке «Экспериментальный метод». Выберите 3 600 с для продолжительности и 60 °C для изотермической температуры, с нулевым значением для времени уравновешивания. Нажмите кнопку "Добавить в экспериментальный метод". Изотермический эксперимент отображается в нижней части экрана. После завершения промойте прибор 2 л деионизированной воды и повторите шаг 2.5.
- Проводите эксперименты с образцами с использованием той же процедуры загрузки ДСК и экспериментальных параметров, что и при эталонном сканировании. Для набора данных о свободных биомолекулах убедитесь, что эталонный капилляр содержит рабочий буфер, в то время как капилляр образца содержит свободную биомолекулу в желаемой концентрации в рабочем буфере.
- Для экспериментов, связанных с лигандом, убедитесь, что лиганд находится в рабочем буфере в референсном капилляре, а биомолекула плюс лиганд — в рабочем буфере в капилляре образца. Промывайте систему между добавлениями различных лигандов, как в шаге 2.5.
- Провести еще один эксперимент с биомолекулой, связанной с термолабильным лигандом, в котором период высокотемпературного равновесия увеличен до 600 с, а все остальные экспериментальные параметры будут такими же, как на шаге 3.2.1.
заметка: Продолжительность периода высокотемпературного равновесия для второго эксперимента, связанного лигандом, просто выбирается для того, чтобы гарантировать, что лиганд истощается быстрее, чем в эксперименте с коротким временем равновесия. Если связанные с лигандом пики в первом эксперименте медленно затухают в зависимости от числа сканирований (например, различия в последовательных пиковых максимумах составляют ≤ 0,5 °C), оцените от 10 до 20-кратного увеличения периода высокотемпературного равновесия, чтобы адекватно истощить лиганд во время второго эксперимента. Точный расчет константы скорости для конверсии лиганда требует, чтобы во втором эксперименте произошло более быстрое истощение лиганда по сравнению с первым. Концентрации лигандов, полученные в результате глобального анализа двух экспериментов, будут аналогичными и, следовательно, непригодными для использования, если истощение лиганда не будет достаточно ускорено во втором эксперименте.
4. Обработка данных
- Откройте файлы экспериментов DSC в программном обеспечении для анализа данных DSC (см. Таблицу материалов) и экспортируйте исходные данные о мощности в виде электронных таблиц.
- Импортируйте электронные таблицы, содержащие исходные данные об энергопотреблении, в программное обеспечение для подгонки данных.
- Исходный уровень Вычесть данные образца путем вычитания данных о мощности буфера из экспериментов со свободными и связанными лигандами биомолекулами.
заметка: В эксперименте с термолабильным лигандом концентрация исходного лиганда уменьшается с каждым сканированием. Поэтому идеально вычесть сканирование буфера 1 из сканирования образца 1 и так далее. Мы обнаружили, что сканирование буфера с кокаином не изменяется заметно по мере превращения лиганда, и поэтому одно сканирование буфера термолабильного лиганда может быть использовано для вычитания всех данных, связанных с термолабильным лигандом.
- Преобразуйте исходные данные о мощности образца в тепловую мощность.
заметка: Для преобразования требуется частичный удельный объем биомолекулы, который можно оценить.
5. Анализ данных
- Глобально совместим набор данных термолабильных лигандов, связанных с теплоемкостью, с коротким временем равновесия с единым набором параметров исходного уровня, концентрации лиганда, сворачивания и связывания лиганда.
- Повторите глобальную аппроксимацию для набора данных о длительном времени равновесия, чтобы вычислить константу скорости для термолабильного преобразования лиганда.
