$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Получение CXCL12, буфера для анализа и клеток Jurkat для анализа связывания конкуренции
- Приготовьте стоковый раствор CXCL12AF647 (20 мкг/мл; см. Таблицу материалов и реактивов) путем растворения лиофилизированного реагента (хранящегося при -80 °С, в темноте) в ультрачистой воде с добавлением 0,01% (объем/объем) полисорбата 20. Храните одноразовые аликвоты из этого стокового раствора при температуре -80 °С, защищенном от света.
- Приготовьте буфер для анализа, добавив 40 мл HEPES (1 M, 20 mM конечная концентрация) в 200 мл сбалансированного солевого раствора Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, 10x, без фенолового красного и без бикарбоната натрия, 1x конечная концентрация). Добавьте сверхчистую воду до получения конечного объема 2 л. Добавьте 4 г (0,2% веса/объема) бычьего сывороточного альбумина (БСА) и растворите БСА с помощью магнитного перемешивания. Наконец, отрегулируйте pH до 7,4 (используйте для этого NaOH) и отфильтруйте раствор через поры размером 0,2 мкм (см. Таблицу материалов и реагентов) с помощью вакуумного коллектора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот буфер для анализа будет использоваться на всех последующих этапах протокола.
- Посчитайте количество и жизнеспособность клеток Юрката. Для этого берут пробу клеточной суспензии и разводят ее в фосфатно-солевом буфере (PBS).
заметка: Мы обычно используем автоматический анализатор жизнеспособности клеток (см. Таблицу материалов и реагентов), способный подсчитывать клеточные суспензии в различных концентрациях. Для подсчета клеток разведите 0,5 мл клеточной суспензии в 1,5 мл PBS (возможны и другие разведения, например, 0,1 мл в 1,9 мл PBS). В продаже имеется несколько других устройств для подсчета количества ячеек и жизнеспособности, которые должны работать одинаково хорошо.
- Соберите желаемое количество клеток (т.е. ~24 x 106 клеток для проведения анализа с одним полным 96-луночным планшетом) в стерильную пробирку объемом 50 мл путем центрифугирования (см. Таблицу материалов и реагентов для типа используемой центрифуги) при 400 x g в течение 5 мин при РТ.
- Аккуратно слейте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Добавьте свежий буфер для анализа (например, 20 мл) и ресуспендируйте клетки, осторожно пипетируя вверх и вниз.
- Снова центрифугируйте клетки при 400 x g в течение 5 мин при RT.
- Снова слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в свежем буфере для анализа до получения плотности 5 x 106 клеток/мл.
2. Анализ связывания с конкуренцией
ПРИМЕЧАНИЕ: Фактический анализ связывания соревнований проводится в RT и может быть выполнен в нестерильных условиях.
- Разведите исследуемые соединения в буфере для анализа (см. 1.2) для получения желаемой концентрации. Либо подготовьте фиксированную концентрацию соединения для первоначального скрининга (например, конечную концентрацию 10 мкМ), либо, в качестве альтернативы, серию серийных разбавлений концентраций для более детальной характеристики соединений (например, серию разбавления 1/3, 1/4 или 1/5, начиная с 1 мкМ, конечная концентрация). Имейте в виду, что раствор соединения в конечном итоге станет в 2 раза разбавленным в анализе; Поэтому приготовьте концентрированный раствор в 2 раза.
- Диспонируйте 100 мкл раствора соединения (в 2 раза концентрированного) в прозрачную круглую нижнюю пластину на 96 лунок (см. Таблицу материалов и реагентов) в соответствии с заранее определенной экспериментальной схемой (например, рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе в анализ включаются отрицательные и положительные контрольные образцы. В отрицательном контрольном образце вместо соединения в лунки 96-луночного планшета добавляют 100 мкл буфера для анализа. Для положительного контрольного образца на этом этапе также добавляется буфер для анализа. На рисунке 1С также приведена типичная экспериментальная схема, в которой проверяется ряд разбавления нескольких соединений.
- Добавьте 50 мкл клеточной суспензии (см. 1,7; 0,25 x 106 клеток) из резервуара с реагентом в 96-луночный планшет с помощью многоканальной пипетки. Инкубируйте тарелку в течение 15 минут при RT в темноте.
- Добавьте 50 мкл флуоресцентно меченного CXCL12 (т.е. 100 нг/мл CXCL12AF647 в буфере для анализа, 4x концентрированный, 25 нг/мл конечной концентрации) из аналогичного резервуара с реагентами в лунки 96-луночного планшета. Инкубировать в течение 30 минут в RT в темноте.
заметка: Для отрицательных контрольных образцов добавьте буфер для анализа. Следовательно, флуоресцентный сигнал, обнаруженный в отрицательных контрольных образцах, будет соответствовать автофлуоресцентному фоновому сигналу (рисунок 1А). Для положительных контрольных образцов добавьте 50 μл/лунку CXCL12AF647. Положительные контрольные образцы дадут обнаруженный максимальный сигнал флуоресценции, поскольку потенциальное ингибирование путем предварительной инкубации с соединениями не было включено (рис. 1A).
- Центрифугируйте 96-луночный планшет при 400 x g в течение 5 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость из гранулированных клеток, перевернув планшет. Высушите пластину на салфетке.
- Добавьте в лунки 200 мкл свежего буфера для анализа из резервуара с реагентами с помощью многоканальной пипетки. Немедленно приступайте.
- Снова центрифугируйте планшет в течение 5 минут при 400 x g при RT. Удалите надосадочную жидкость, перевернув пластину, и снова высушите ее на салфетке.
- Аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл 1% параформальдегида, растворенного в PBS. Этот шаг позволит закрепить клетки.
- Немедленно продолжите протокол количественным определением флуоресценции с помощью проточной цитометрии.
3. Анализ образцов методом проточной цитометрии
Окрашенные и зафиксированные клетки
CXCL12AF647 теперь готовы к анализу с помощью проточной цитометрии. Можно использовать несколько типов проточных цитометров, но они должны быть оснащены правильным лазером (т.е. красным лазером, диапазон возбуждения ~630 нм) для возбуждения и подходящими фильтрами для детектирования флуорофоров (эмиссионные фильтры ~660 нм). Они должны быть способны работать с образцами в формате 96-луночных планшетов. Примеры подходящих устройств для проточной цитометрии приведены в Таблице материалов и реактивов.
- Запустите прибор и откройте соответствующее программное обеспечение (см. Таблицу материалов и реагентов).
- Выберите следующие параметры сотовой связи для визуализации в формате точечного блоттинга: прямое рассеяние (FSC), боковое рассеяние (SSC) и канал обнаружения флуорофора (CXCL12AF647).
заметка: С помощью параметра FSC ячейки различаются по размеру, так как обнаруженное поглощение света пропорционально диаметру ячейки. Параметр SSC, измеряющий рассеяние света под углом 90°, предоставляет информацию о зернистости ячеек.
- Выберите один образец (например, отрицательный контрольный образец) для выполнения гейтирования определенной однородной популяции клеток на основе параметров FSC и SSC.
- Выберите автоматическое введение ~100 мкл фиксированных клеток из этого отрицательного контрольного образца в проточный цитометр. Выберите опцию «смешивание» перед впрыском и используйте скорость потока образца 1,5 мкл/с.
- Запустите этот пример, выбрав «Получить данные». Параметры FSC и SSC для этого примера появятся на экране.
- Выберите инструмент стробирования программного обеспечения. Основываясь на визуализации FSC и SSC dot blot, предварительно определите однородную и жизнеспособную популяцию клеток с помощью гейтирования. Для этого создайте многоугольник (с помощью программного инструмента стробирования), который включает в себя однородно распределенные одиночные ячейки («события») на основе этих двух измерений.
заметка: Процедура гейтирования направлена на определение однородной и жизнеспособной популяции клеток, которая будет использоваться для дальнейшего анализа. Гейтинг основан на предположении, что большинство жизнеспособных клеток сформируют однородную клеточную популяцию на основе параметров FSC и SSC. Выполняя этот шаг, клеточный мусор, мертвые клетки и клеточные агрегаты могут быть в значительной степени исключены из дальнейшего анализа. Иллюстрация процесса литникования приведена на рисунке 1В.
- Выберите для анализа 20 000 «событий» (т.е. отдельных клеток) на образец.
заметка: Это означает, что для каждого образца в конечном итоге будут проанализированы 20 000 клеток, попадающих в заранее определенный вентиль. Сбор данных для каждой выборки будет продолжаться до тех пор, пока не будет проанализировано это количество событий.
- Запустите прогон (выберите «Записать данные»). Устройство проточной цитометрии теперь будет анализировать все образцы один за другим, записывая среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) для каждого образца. Этот MFI соответствует среднему флуоресцентному сигналу, соответствующему 20 000 ячеек, которые попадают в заданный вентиль.
