1. Генерация плазмиды, выражающей химерную конструкцию
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы создать плазмиду, которая экспрессирует внеклеточный домен интересующего рецептора, слитый с трансмембранными и внутриклеточными доменами мышиной цепи CD3ζ (Рисунок 1A).
- Получите последовательность внеклеточного домена интересующего рецептора, включая сигнальный пептид. Получите материал ДНК, который, как ожидается, будет экспрессировать этот рецептор (например, кДНК или плазмиду).
- Получить материал ДНК, который экспрессирует трансмембранные и внутриклеточные домены мышиной цепи CD3ζ (например, кДНК или плазмиду).
- Спроектируйте последовательность гибридного белка на основе общей структуры, показанной на рисунке 1А. Убедитесь, что вся последовательность находится в одной рамке считывания кодонов. Эта последовательность используется для разработки соответствующих грунтовок и проверки конечного продукта.
- Спроектируйте две ПЦР-реакции для амплификации каждого из фрагментов гибридных белков по отдельности (рис. 1B, 1C).
заметка: Специфические условия для ПЦР-реакций (например, время удлинения и температура отжига) зависят от природы праймеров, которые предназначены для конкретного рецептора.
- Амплифицируйте внеклеточный сегмент рецептора.
- Разработайте 5'-праймер, который включает в себя часть сигнального пептида рецептора, консенсусную последовательность Козака и соответствующий сайт рестрикции (рис. 1B).
- Разработайте 3'-праймер, который фланкирует обе части гибридного белка (Рисунок 1B). Например, для начального дизайна этот 3'-праймер может включать последние 20 пар оснований внеклеточного сегмента рецептора и первые 9 пар оснований сегмента CD3ζ.
заметка: Нет необходимости добавлять сайт рестрикции к 3'-праймеру, так как этот праймер будет использоваться для генерации слитой последовательности и не используется для лигирования.
- Амплифицируйте сегмент CD3ζ.
- Разработайте 5'-праймер, который будет обрамлять обе части гибридного белка (Рисунок 1C). Например, для исходного дизайна 5'-праймер может включать последние 9 пар оснований внеклеточного сегмента рецептора и первые 20 пар оснований сегмента CD3ζ.
заметка: Нет необходимости добавлять сайт рестрикции к 5'-праймеру, так как этот праймер будет использоваться для генерации слитой последовательности и не используется для лигирования.
- Разработайте 3'-праймер, который включает в себя конец последовательности CD3ζ, а также соответствующий сайт рестрикции (рисунок 1C).
- Корректируйте последовательности праймеров в каждой из этих двух реакций так, чтобы температура отжига была одинаковой в каждой паре (обратите внимание, что праймер, который включает в себя последовательности двух частей гибридного белка, отжигает только с частью последовательности в каждой реакции).
- Проводят дополнительную ПЦР, в которой смесь продуктов ПЦР первых двух реакций используют в качестве матрицы ДНК с 5'-праймером сегмента внеклеточного рецептора (Шаг 1.4.1.1) и 3'-праймером сегмента CD3ζ (Шаг 1.4.2.2) (Рисунок 1D). Эта реакция должна привести к образованию окончательной последовательности сплавления.
- Действуйте как обычно для клонирования.
- Литурируйте конечный продукт ПЦР до целевого вектора среза (целевым вектором обычно является pcDNA3, который экспрессирует G418 и устойчивость к ампициллину).
- Трансформируйте лигированный вектор в компетентные бактерии.
- Разморозьте 50 мкл компетентных бактерий на льду.
- Добавьте к бактериям лигированный вектор и инкубируйте на льду в течение 20 минут.
- Выдерживать при температуре 42 °C в течение 45 с.
- Добавьте 200 μL LB без антибиотиков.
- Выдерживать в течение 1 ч при температуре 37 °C при непрерывном встряхивании.
- Посадите семена на LB-планшет с соответствующими антибиотиками (например, раствор ампициллина с конечной концентрацией 0,1 мг/мл).
- Соберите и вырастите несколько колоний бактерий в 5 мл LB (в пробирках по 15 мл).
- На следующий день извлеките плазмиды с помощью мини-набора.
- Проанализируйте генную вставку с помощью ферментов рестрикции.
- Секвенируйте соответствующие колонии и убедитесь в правильности последовательности и рамки считывания (как указано в шаге 1.3).
- Превратите проверенную плазмиду в компетентные бактерии.
- Разморозьте 20 мкл компетентных бактерий на льду.
- Добавьте к бактериям 1 μл плазмиды и инкубируйте на льду в течение 20 минут.
- Выдерживать при температуре 42 °C в течение 45 с.
- Добавьте 200 μL LB без антибиотиков.
- Выдерживать в течение 1 ч при температуре 37 °C при непрерывном встряхивании.
- Посадите семена на бактериальную пластину для роста с соответствующими антибиотиками (например, раствором ампициллина с конечной концентрацией 0,1 мг/мл).
- На следующий день вырастите бактериальную колонию в большом контейнере LB с 0,1 мг/мл ампициллина (~250 мл).
- На следующий день выполните макси-подготовку в соответствии с конкретными инструкциями, предоставленными набором.
заметка: Для процедуры электропорации требуется большое количество плазмиды, как описано ниже.
2. Трансфекция плазмиды, экспрессирующей химерный белок, в клетки BW
ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансфекции также могут быть использованы различные методы (например, при лентивирусной инфекции). Перед электропорацией выполните осаждение ДНК этанолом, как описано ниже. Следующие шаги требуют стерильных условий.
- Накануне подготовьте элементы BW5147 («элементы BW») к электропорации. Планшет 10 планшетов (по 10 см) с 10 мл 100 000 BW5147 клеток/мл (т.е. всего 10 x10 6 клеток) с RPMI с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 1% пирувата натрия, 1% L-глутамина, 1% заменимых аминокислот и 1% пенициллин-стрептомицина («полная среда»).
- Поместите 100 мкг плазмиды pcDNA3, экспрессирующей гибридный белок, в пробирку объемом 1,5-2 мл и добавьте к ней 3 М ацетата натрия при pH 5,3-5,5. Объем ацетата натрия должен соответствовать 0,1 (10%) от объема 100 мкг плазмиды; титровать pH ацетата натрия с помощью рН-метра путем добавления NaOH или HCl.
- Добавьте 2,5 объема 100% этанола в смесь плазмиды и ацетата натрия, как описано в шаге 2.2 (в 2,5 раза больше общего объема плазмиды и ацетата натрия). Инкубировать в течение ночи при -20 °C или в течение 2 часов при 70 °C.
- Через 24 ч после того, как клетки БО были плюированы, соберите все клетки БО (~100 мл) в 2 пробирки по 50 мл. Центрифугируйте клетки в течение 5 минут при 515 х г и выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте гранулу из обеих пробирок в 25 мл RPMI- в одной пробирке объемом 50 мл. Например, ресуспендируйте гранулу одной пробирки 25 мл RPMI, а затем используйте эту жидкость для повторного суспендирования жидкости в другой трубке объемом 50 мл так, чтобы вся гранула из ячеек BW была повторно суспендирована в 25 мл среды в одной пробирке><.
заметка: Среда должна быть без добавок, так как сыворотка может препятствовать электропорации.
- Снова центрифугируйте клетки в течение 5 мин при 515 x g. Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл РПМИ, и переложите содержимое в кювету диаметром 0,4 см на лед.
- Центрифугируйте плазмиду, подвергшуюся осаждению этанола (стадия 2.3), в течение 30 мин при 16 000 x g и 4 °C.
- Промойте один раз 1 мл 70% этанола и центрифугируйте еще 20 минут при температуре 16 000 x g и 4 °C (чтобы смыть соль).
- Удалите весь этанол и дайте грануле немного подсохнуть (т.е. в открытой пробирке в вытяжке для культуры тканей). Повторно суспендируйте гранулу в 100 мкл RPMI, предварительно нагретого до 60 °C.
- Добавьте ресуспендированную плазмиду (Шаг 2.8) в клетки кюветы и инкубируйте в течение 5 минут на льду.
- Электропорировать элементы при напряжении 0,23 кВ, емкость 250. Это должно занять ~4 мс.
- Перенесите электропорированные ячейки в пробирку объемом 50 мл, добавьте 50 мл готовой среды и центрифугируйте в течение 5 мин при 5,15 x g.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки 50 мл готовой среды.
- Выложите электропорированные клетки в 24-луночные чашки для культур (1 мл на лунку, всего ~50 лунок) и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2 в течение 48 часов.
- Отбирают трансфицированные клетки с антибиотиками. Через 48 ч добавьте 1 мл готовой среды с добавлением 10 мг/мл G418 в каждую лунку (на этом этапе конечный объем в каждой лунке составляет 2 мл, а конечная концентрация G418 в каждой лунке составляет 5 мг/мл).
заметка: Если плазмида содержит другую устойчивость к антибиотикам, определите концентрацию антибиотика, необходимую для уничтожения нетрансфицированных клеток БО до этого этапа.
- Каждые 48 ч осторожно сбрасывайте 1 мл верхнего объема каждой лунки, не перемешивая среду в лунке (ячейки BW, как правило, находятся на дне лунки). Добавьте в каждую лунку полную среду с добавлением 5 мг/мл G418, чтобы конечный объем в каждой лунке снова составил 2 мл.
- Регулярно проверяйте культуральные планшеты на предмет роста клеток во всех лунках.
заметка: Изменение цвета среды на желтый может помочь идентифицировать растущие клетки; однако, в начале, носитель будет желтым из-за самого G418. Определите положительные лунки (лунки с растущими клетками). Эти лунки устойчивы к G418 и поэтому должны экспрессировать гибридный белок. Этот процесс обычно занимает ~3 недели.
3. Проверка экспрессии трансфицированного рецептора в клетках в положительных лунках.
- Окрашивание трансфицированных клеток БО специфическим антителом против рецептора, который был трансфицирован.
- Сравните уровень экспрессии рецептора с помощью проточной цитометрии с экспрессией контрольных клеток (нетрансфицированных клеток BW).
- После проверки одной или нескольких лунок немедленно используйте клетки в экспериментальных целях, выращивайте их в культуре или замораживайте для будущего применения.
- Проверьте экспрессию трансфицированного рецептора перед проведением нового эксперимента. После нескольких недель роста клетки с G418 со стабильной экспрессией рецепторов, G418, могут быть исключены из питательной среды.
4. Инкубация трансфицированных клеток БО с мишенями
ПРИМЕЧАНИЕ: При первом использовании трансфицированных BW-клеток предпочтительно тестировать их на мишенях, экспрессирующих известный лиганд интересующего рецептора, или на антителах, связанных с пластинами, специально направленных против интересующего рецептора (эксперименты по сшиванию; см. ниже, раздел 4.2.1.3).
- Предпочтительно разделить клетки БО за 24 ч до эксперимента (например, добавив 10 мл полной среды к 2 мл клеток в культуре в новой 10-сантиметровой культуральной тарелке).
- Инкубируйте трансфицированные клетки БО с их мишенями. Эксперимент проводится одновременно на контрольных клетках БО, экспрессирующих пустой вектор (или родительских клетках БО). Предпочтительнее пластины 96F (но можно использовать и пластины 96U). Проведите эксперимент в трех экземплярах. Подвесьте все клетки в готовую среду.
- Подготовьте мишени. Тип мишени варьируется в зависимости от цели и может быть клеткой, клетками, которые были предварительно инкубированы антителами, или только антителами. Эта система также использовалась с бактериями в качестве мишеней.
- Если мишенями являются делящиеся клетки (т.е. клеточные линии), облучите их при 6000 рад перед анализом. Поместите 50 000 целевых ячеек в одну лунку планшета 96 (объемом 100 мкл).
- Для экспериментов с антителами и клетками БО, экспрессирующими FcγR человека, инкубируют клетки-мишени с антителом на льду в 96-луночной пластине (например, 50 мкл клеток-мишеней и 50 мкл антитела; можно тестировать различные дозы антител).
- При использовании только антител в качестве мишеней (эксперименты по сшиванию), они должны быть привязаны к планшетам. С этой целью антитела сначала инкубируют в полной среде в планшете 96F в течение 1-2 ч при 37 °C и 5%CO2 (типичная начальная доза составляет 0,5 мкг специфического антитела в 50 мкл). Промойте пластину, чтобы удалить несвязанные антитела.
заметка: В этом случае пластина 96F обеспечит связывание антитела с пластиной, что после добавления трансфицированных клеток BW приведет к активации трансфицированного рецептора.
- Добавьте ячейки BW (эффекторные ячейки). Поместите 50 000 BW ячеек в одну лунку из 96 планшетов (в объеме 100 мкл).
- При необходимости доведите объем в каждой лунке до 200 μл.
- Инкубируйте планшеты при 37 °C и 5%CO2 в течение 48 часов (этот период времени можно откалибровать).
- Через 48 часов заморозьте пластины при температуре -20°C и разморозьте их перед ИФА или используйте их сразу для ИФА (см. следующие шаги).
5. ИФА
- Покройте пластину ИФА антителом против мыши IL-2 (anti-mIL-2). Поместите 0,05 мкг анти-мИЛ-2 в объем 50 мкл 1x PBS (фосфатный буферный раствор) на лунку. Инкубировать покрытый ИФА планшет с антителом против mIL-2 при 4 °C в течение ночи или при 37 °C в течение 2 ч.<бр/>
заметка: Для проведения ИФА непосредственно после стадии инкубации планшет ИФА должен быть покрыт за 24 ч до окончания инкубационного периода клеток МТ.
- Слейте жидкость из планшета ИФА и добавьте блокирующий раствор (200 мкл на лунку), который состоит из 1x PBS и 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Инкубируйте планшет для ИФА в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Промойте пластину ИФА три раза 0,05% раствором PBS Tween (т.е. 0,5 мл Tween-20 на 1 литр 1x PBS).
- Возьмем планшет 96, на котором изображены клетки БО, которые были инкубированы со своими мишенями (4.3). Если тарелка была заморожена, полностью разморозьте ее (например, путем короткой инкубации при 37 °C). Центрифугируйте 96-луночный планшет (5 мин, 515 x g) и осторожно перенесите 100 мкл надосадочной жидкости из каждой лунки на предварительно покрытый и заблокированный планшет ELISA.
заметка: Надосадочная жидкость должна собираться с боков каждой лунки, чтобы избежать взятия клеток.
- При желании добавьте рекомбинантный мИЛ-2 с определенными концентрациями в один из пустых рядов пластины ИФА с покрытием, чтобы получить стандартную кривую мИЛ-2. Например, начните с концентрации мИЛ-2 2 500 пг/мл и затем снижайте на 50% в каждой последующей скважине; Не добавляйте мИЛ-2 в последнюю лунку.
- Инкубируйте планшет ИФА при 4 °C в течение ночи или при 37 °C в течение 2 часов.
- Вымойте пластину ИФА четыре раза с помощью PBS Tween.
- Добавьте биотин антимышиный IL-2 в пластину для ИФА. Используйте концентрацию 1 мкг антитела в 1 мл 1x PBS с 1% BSA и разделите на 100 мкл на лунку.
- Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Вымойте пластину ИФА шесть раз с помощью PBS Tween.
- Добавьте HRP-конъюгированный стрептавидин. Используйте концентрацию 1 мкл стрептавидина в 1 мл PBSX1 с 1% БСА и разделите его на 100 мкл на лунку.
- Выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут.
- Вымойте пластину ИФА шесть раз с помощью PBS Tween.
- Добавьте 100 μL на лунку раствора субстрата TMB. Завершите этот этап быстро, чтобы свести к минимуму различия между скважинами из-за временных задержек при добавлении TMB.
- Считывание показаний планшета ИФА с помощью считывателя пластин ИФА на длине волны 650 нм (показания могут быть повторены при слабом сигнале).
