1. Выделение эритроцитов человека, биотинилирование и регулировка осмолярности
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1.1 должен выполняться обученным медицинским работником, таким как медсестра, с протоколом, одобренным Институциональным наблюдательным советом.
- Получите 8-10 мкл (одну каплю) крови из укола пальца и добавьте ее к 1 мл буфера карбонат/бикарбонат (Список материалов). Аккуратно перемешайте смесь или сделайте пиджакетом и центрифугируйте в течение 1 минуты при плотности 900 x g. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте еще раз.
- В маленьком стакане весят 3,5-4 мг линкера Biotin-PEG3500-NHS (Список материалов). Растворите его в буфере карбонат/бикарбонат до конечной концентрации 3 мг/мл.
- Смешайте 171 мкл карбонатно-бикарбонатного буфера, 10 мкл пакета эритроцитов и 1049 мкл раствора линкера Biotin-PEG3500-NHS и инкубируйте при RT в течение 30 мин. Промойте эритроциты один раз карбонатным/бикарбонатным буфером, а затем дважды N2-5% буфером (список материалов).
- Тем временем поместите флакон с линкером с ослабленной крышкой в стеклянный вакуумный эксикатор, заполненный влагопоглотителем на дно, и пропылесосьте 5 мин, а затем заполните эксикатор аргоном. Затяните крышку и выньте бутылку. Закройте бутылку пластиковой парафиновой пленкой (Список материалов), поместите ее в контейнер, наполненный влагопоглотителями на дне, и храните при температуре -20 °C.<бр/>
заметка: Действия, которые предполагают использование линкера Biotin-PEG3500-NHS, в том числе 1.2-1.4 (за исключением инкубации и промывки в 1.3), должны быть выполнены как можно быстрее.
- Разведите нистатин в N2-5% буфере до получения конечной концентрации 40 мкг/мл. Смешайте 5 мкл биотинилированных эритроцитов с 71,4 мкл раствора нистатина (список материалов) и инкубируйте в течение 1 часа при 0 °C. Дважды промойте с N2-5% буфером и храните с N2-5% буфером + 0,5% BSA (список материалов) в холодильнике (4 °C).
2. Силанизация стеклянных шариков
- Очистка поверхности борта
- Взвесьте 50 мг порошка стеклянных шариков и повторно суспендируйте их в 500 мкл деионизированной воды.
- Смешайте 0,5 мл 30% H2O2 (список материалов) с 9,5 мл воды DI в стакане объемом 50 мл, затем добавьте 2 мл концентрированного NH4OH (список материалов) и поднесите этот раствор к бойлеру на горячей плите.
- Добавьте стеклянные шарики в кипящий раствор и продолжайте кипятить еще 5 минут. Аккуратно помешивайте раствор каждую минуту.
- После закипания перелейте ~5 мл этой горячей суспензии в микроцентрифугу объемом 15 мл и долейте воду RT DI. Центрифугируйте при 3 500 x g в течение 5 минут, удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
- Перелейте еще 5 мл горячей суспензии и добавьте к промытым шарикам, долейте еще воды DI, хорошо перемешайте и снова центрифугируйте. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока не будет использовано около 50 мл воды DI, что в общей сложности составит от 4 до 5 раз для стирки.
- Переложите суспензию в бусины во флакон объемом 1 мл. Повторите промывку бусин метанолом (Список материалов) центрифугированием при 17 000 х г в течение 5 минут 3 раза, и, наконец, снова суспендируйте бусины в 1 мл 100% метанола.
- Тиолирование поверхности валика
- В центрифужную пробирку объемом 50 мл добавляют 45,6 мл метанола, 0,4 мл уксусной кислоты (Перечень материалов), 1,85 мл воды DI, 1,15 мл 3-меркаптопропилтриметоксисилана (МПТМС) (Перечень материалов) и 1 мл гранул суспензии, приготовленной в 2,1 мл, затем инкубируют при РТ в течение 3 ч.
- После реакции удалите все реагенты, промыв их один раз свежим метанолом, и повторно суспендируйте гранулы в 500 мкл метанола. Равномерно разделите эту концентрированную суспензию на набор из 20 сухих и чистых стеклянных флаконов с завинчивающимися крышками. Испарите метанол с помощью струи сухого аргона и медленно вращайте флаконы так, чтобы на стенках каждого флакона образовался тонкий слой сухих шариков.
- Поместите флаконы с шариками в предварительно разогретую сушильную печь до 120 °C на 5 минут, а затем выньте и быстро наденьте крышку (крышки). Поместите флаконы в стеклянный вакуумный эксикатор, наполненный влагопоглотителями на дно, и вакуумируйте эксикатор вакуумным насосом до полного остывания.
- Продуйте вакуумированный эксикатор сухим аргоном, чтобы довести эксикатор до нормального атмосферного давления. Снимите крышку эксикатора и быстро снова затяните колпачк(и) на флаконе. Запечатайте флаконы пластиковой парафиновой пленкой и храните их при температуре RT в сухом темном ящике для хранения.
- При немедленном использовании возьмите один флакон сухих шариков и промойте один раз фосфатным буфером (список материалов), повторно суспендируйте в 50 мкл фосфатного буфера и храните при температуре 4 °C. На следующих этапах это приготовление концентрированных шариков будет называться «шариками MPTMS».
заметка: При правильном хранении бусины MPTMS могут оставаться функциональными до трех месяцев.
3. Функционализация бусин
- Ковалентное покрытие белков на бусинах
- Возьмите определенный объем (например, 2,5 мкл) белкового запаса и смешайте его с равным объемом буфера карбонат/бикарбонат, чтобы получить раствор 1,<бр/>
заметка: Объем зависит от концентрации притока и желаемой конечной плотности расположения белка на поверхности шариков.
- В маленьком стакане взвесьте 2-3 мг линкера MAL-PEG3500-NHS (список материалов) и растворите его с карбонатно-бикарбонатным буфером до достижения конечной концентрации 0,231 мг/мл.
- Смешайте раствор 1 с равным объемом раствора линкера, приготовленного в. 3.1.2. Инкубируйте смесь при RT в течение 30 минут, чтобы получить раствор 2.
- Тем временем поместите флакон с линкером с ослабленной крышкой в стеклянный вакуумный эксикатор, заполненный влагопоглотителем на дно, и пропылесосьте 5 мин, а затем заполните эксикатор аргоном. Затяните крышку и выньте бутылку. Запечатайте бутылку пластиковой парафиновой пленкой, поместите ее в емкость, наполненную влагопоглотителями на дне, и храните при температуре -20 °C.<бр/>
заметка: Шаги, связанные с использованием линкера MAL-PEG3500-NHS, включая 3.1.2-3.1.4 (за исключением инкубации в 3.1.3), должны быть выполнены как можно быстрее.
- Смешайте 5 мкл гранул MPTMS с раствором 2 и добавьте фосфатный буфер (список материалов), чтобы получить итоговый объем 250 мкл.
- Инкубируйте шарики в течение ночи при RT, 3 раза промойте фосфатным буфером и повторно суспендируйте в 100 мкл фосфатного буфера и храните при температуре 4 °C.
- Приготовление гранул, покрытых белком/стрептавидином (SA)
- Следуйте протоколу 3.1.1-3.1.4.
- Смешайте 5 μл гранул MPTMS с раствором 2 и 5 μл 4 мг/мл раствора стрептавидин-малеимида (SA-MAL) (Список материалов), а затем добавьте фосфатный буфер, чтобы получить окончательный объем 250 μл.
- Инкубируйте шарики в течение ночи при RT, промойте 3 раза фосфатным буфером и, наконец, повторно суспендируйте в 100 μл фосфатного буфера и храните при 4 °C.
- Нанесение стрептавидина на стеклянные шарики
- Смешайте 5 μл гранул MPTMS с 5 μл 4 мг/мл раствора SA и добавьте 140 μл фосфатного буфера.
- Инкубируйте шарики в течение ночи при RT, 3 раза промойте фосфатным буфером, повторно суспендируйте в 50 мкл фосфатного буфера и храните при температуре 4 °C.
- Покрытие гранул SA биотинилированным белком
- Смешайте 5 μл гранул, покрытых SA, с белком (объем зависит от желаемой плотности покрытия) и добавьте фосфатный буфер, чтобы конечный объем составил 100 μл.
- Смесь инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C или в течение 3 часов при RT, 3 раза промыть фосфатным буфером, повторно суспендировать в 50 мкл фосфатного буфера и хранить при температуре 4 °C.
4. Подготовка клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы очистить клетки, следуйте стандартным протоколам очистки клеток, соответствующим типу используемых клеток, например, Т-клетки или определенные клеточные линии.
- Для экспериментов fBFP, после приготовления клеточной суспензии, добавьте в клеточную суспензию Fura2-AM (список материалов), растворенный в ДМСО, до конечной концентрации 2 мкМ, инкубируйте в течение 30 минут при RT, а затем промойте один раз. Храните эту флуоресцентно нагруженную клеточную суспензию в темноте до использования.
5. Подготовка к микропипеткам и камере для клеток
- Подготовка микропипеток
- Разрежьте длинные трубки из капиллярного стекла (список материалов) с помощью стеклореза на короткие кусочки длиной около 3 дюймов. Установите одну деталь на съемник микропипеток (список материалов), нажмите кнопку «Потянуть», чтобы середина капилляра нагревалась машиной, а капилляр был натянут на два конца, чтобы сделать два капилляра с острыми кончиками (необработанные микропипетки).
заметка: Следуя рекомендациям по продукту, желаемая морфология необработанного пипетки имеет конус 6-8 мм и наконечник 0,1-0,5 мкм.
- Установите необработанный пипетку на держатель пипетки кузницы для микропипеток (список материалов). Тепло расплавить стеклянную сферу на горне. Вставьте кончик необработанной пипетки внутрь стеклянной сферы. Охладите стеклянную сферу и потяните за необработанную пипетку, чтобы разбить ее снаружи и оставить ее кончик внутри сферы. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока не будет получено желаемое отверстие для наконечника.
заметка: Примеры внутреннего диаметра наконечника микропипетки: 2,0-2,4 мкм для эритроцита, ~1,5 мкм для шарика, ~2-4 мкм для Т-клетки и -7 мкм для гибридомной клетки.
- Создание камеры камеры
ПРИМЕЧАНИЕ: камера ячейки построена на основе самодельного держателя камеры, который состоит из двух кусков металлических квадратов (медь/алюминий) и ручки, которая связывает их между собой (рисунок 1D).
- Разрежьте покровное стекло размером 40 мм x 22 мм x 0,2 мм с помощью стеклореза на две части размером 40 мм x 11 мм x 0,2 мм (покровные стекла 1 и 2). Приклейте покровное стекло 1 с помощью смазки к верхней стороне держателя камеры таким образом, чтобы он соединял два металлических квадрата, и аналогичным образом приклейте покровное стекло 2 к нижней стороне, что образует параллельную камеру ячейки покровного стекла (рисунок 1D).
- С помощью пипетки введите 200 мкл экспериментального буфера между двумя покровными стеклами. Убедитесь, что буфер прикреплен к обоим покровным стеклам. Осторожно поверните и встряхните камеру, чтобы буфер коснулся обоих концов камеры.
- Осторожно впрыскивайте минеральное масло с обеих сторон камеры, обойдя экспериментальную буферную зону, тем самым изолируя буфер от открытого воздуха. Вводите суспензии зондовых шариков (например, гранул с покрытием pMHC), эритроцитов и мишеней (например, Т-клеток) в верхнюю, среднюю и нижнюю области буферной зоны соответственно.
4. Эксперимент BFP
- Включите микроскоп (Список материалов) и источник света. Поместите камеру на основной предметный столик микроскопа (рис. 1A, D).
- Установите все три микропипетки BFP (Рисунок 1D. Слева: зонд, чтобы схватить эритроцит, справа: мишень, чтобы схватить клетку или бусину, внизу справа: помощник, чтобы схватить бусину).
- Используйте микроинъектор (список материалов) для заполнения микропипетки экспериментальным буфером. Снимите держатель пипетки (Список материалов) и держите его в более низком месте, чтобы вода могла капать с наконечника. Быстро вставьте микропипетку в наконечник держателя и убедитесь, что во время введения в микропипетку не попадут пузырьки воздуха. Затяните винт держателя.
- Установите каждый держатель пипетки на соответствующий микроманипулятор. Подтолкните микропипетку к камере так, чтобы их кончики вошли в буферную зону камеры. Отрегулируйте положение микропипеток и найдите их под полем зрения микроскопа.
- Перемещайтесь по ступеням держателя камеры, чтобы найти колонии трех элементов (эритроцитов, мишеней и бусин зонда) один за другим. Отрегулируйте положение соответствующей микропипетки, поворачивая ручки манипуляторов так, чтобы кончик микропипетки приблизился на одну клетку/шарик. Аспирируйте клетку/шарик, регулируя давление внутри соответствующей микропипетки. Все три микропипетки будут захватывать соответствующие элементы.
- Перемещайтесь вокруг ступеней держателя камеры, чтобы найти открытое пространство вдали от колоний вводимых элементов, где будет проводиться эксперимент. Переключите визуальный режим микроскопа для визуализации изображения в компьютерной программе на экране компьютера. Переместите все три элемента на наконечниках пипеток в поле зрения программы.
- Совместите валик щупа и эритроциты и осторожно переместите бусину щупа к вершине эритроцита, кратковременно прижмите бусину к эритроцитам и осторожно втяните. Отрегулируйте давление вспомогательной микропипетки, чтобы аккуратно сдуть шарик, чтобы она осталась приклеенной к верхушке эритроцитов (Рисунок 1F). Отодвиньте вспомогательную микропипетку и совместите мишень и бусину зонда (рисунок 2A).
- В программе в окне поля зрения используйте инструменты программы для измерения соответствующих радиусов зондовой микропипетки (Rp), эритроцита (R0), круговой зоны контакта между эритроцитом и зондовым шариком (Rc), что позволяет оценить пружинную постоянную эритроцита (k) по следующему уравнению, где Δp - давление аспирации на наконечнике зондовой пипетки. Примечание: Из закона Гука следует, что связывающая сила, F, может быть количественно определена как произведение постоянной пружины и смещения шарика зонда (d), т.е. F = d (рис. 2C).
- Введите в программу желаемую пружинную константу эритроцитов (см. раздел протокола 4.6. Пружинная постоянная обычно устанавливается на уровне 0,25 или 0,3 пН/нм для анализа силового зажима и анализа частоты адгезии и 0,1 пН/нм для анализа тепловых колебаний), что возвращает требуемое давление аспирации в единицу сантиметра воды. Отрегулируйте высоту резервуара для воды, который соединяется с пипеткой зонда, пока не будет достигнуто требуемое давление аспирации.
- Нарисуйте горизонтальную линию поперек вершины эритроцита, в результате чего в соседнем окне появится кривая, указывающая яркость (значение оттенков серого) каждого пикселя вдоль этой линии. Перетащите пороговую линию примерно на половину глубины кривой (рис. 2A, B).
заметка: Минимальная точка на кривой яркости ниже пороговой линии указывает на положение границы бусины, таким образом, допускается только один локальный минимум. Если в настоящее время есть два или более локальных минимума, это указывает на то, что изображение не является оптимальным (вероятно, из-за того, что изображение не в фокусе или из-за плохого выравнивания между пробником и эритроцитами).
- Выберите нужный режим эксперимента: анализ тепловых флуктуаций, анализ частоты адгезии или силовой зажимной анализ. Установите желаемые параметры (например, сила соударения = 15 пН, скорость нагрузки = 1 000 пН/с, время контакта = 1 сек, усилие зажима = 20 пН (для анализа силы зажима) и т. д.).
- Нажмите «Пуск», чтобы программа могла перемещать пипетку-мишень и вводить мишень в контакт с зондом и из него (подробнее см. раздел «Репрезентативные результаты»). Параллельно будет производиться сбор данных, который фиксирует положение щупа в режиме реального времени. Остановите программу, нажав на кнопку «Остановить эксперимент», после чего появится окно, позволяющее сохранить полученные данные.
