Биомембранный силовой зонд для количественного определения рецептор-лигандных взаимодействий

Аннотация

Источник: Chen, Y., et al., Флуоресцентный биомембранный силовой зонд: одновременное количественное определение кинетики рецептор-лиганда и индуцированной связыванием внутриклеточной сигнализации на одной клетке. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео биомембранные силовые зонды (BFP) используются для измерения сил между рецепторами и лигандами. Этот метод позволяет обнаруживать взаимодействия, контролируя давление, необходимое для разрыва связей между pMHC, конъюгированными на зондовых шариках, и TCR на клетках-мишенях.

Протокол

1. Выделение эритроцитов человека, биотинилирование и регулировка осмолярности

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1.1 должен выполняться обученным медицинским работником, таким как медсестра, с протоколом, одобренным Институциональным наблюдательным советом.

1. Получите 8-10 мкл (одну каплю) крови из укола пальца и добавьте ее к 1 мл буфера карбонат/бикарбонат (Список материалов). Аккуратно перемешайте смесь или сделайте пиджакетом и центрифугируйте в течение 1 минуты при плотности 900 x g. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте еще раз.
2. В маленьком стакане весят 3,5-4 мг линкера Biotin-PEG3500-NHS (Список материалов). Растворите его в буфере карбонат/бикарбонат до конечной концентрации 3 мг/мл.
3. Смешайте 171 мкл карбонатно-бикарбонатного буфера, 10 мкл пакета эритроцитов и 1049 мкл раствора линкера Biotin-PEG3500-NHS и инкубируйте при RT в течение 30 мин. Промойте эритроциты один раз карбонатным/бикарбонатным буфером, а затем дважды N2-5% буфером (список материалов).
4. Тем временем поместите флакон с линкером с ослабленной крышкой в стеклянный вакуумный эксикатор, заполненный влагопоглотителем на дно, и пропылесосьте 5 мин, а затем заполните эксикатор аргоном. Затяните крышку и выньте бутылку. Закройте бутылку пластиковой парафиновой пленкой (Список материалов), поместите ее в контейнер, наполненный влагопоглотителями на дне, и храните при температуре -20 °C.<бр/> заметка: Действия, которые предполагают использование линкера Biotin-PEG3500-NHS, в том числе 1.2-1.4 (за исключением инкубации и промывки в 1.3), должны быть выполнены как можно быстрее.
5. Разведите нистатин в N2-5% буфере до получения конечной концентрации 40 мкг/мл. Смешайте 5 мкл биотинилированных эритроцитов с 71,4 мкл раствора нистатина (список материалов) и инкубируйте в течение 1 часа при 0 °C. Дважды промойте с N2-5% буфером и храните с N2-5% буфером + 0,5% BSA (список материалов) в холодильнике (4 °C).

2. Силанизация стеклянных шариков

1. Очистка поверхности борта
   1. Взвесьте 50 мг порошка стеклянных шариков и повторно суспендируйте их в 500 мкл деионизированной воды.
   2. Смешайте 0,5 мл 30% H₂O₂ (список материалов) с 9,5 мл воды DI в стакане объемом 50 мл, затем добавьте 2 мл концентрированного NH₄OH (список материалов) и поднесите этот раствор к бойлеру на горячей плите.
   3. Добавьте стеклянные шарики в кипящий раствор и продолжайте кипятить еще 5 минут. Аккуратно помешивайте раствор каждую минуту.
   4. После закипания перелейте ~5 мл этой горячей суспензии в микроцентрифугу объемом 15 мл и долейте воду RT DI. Центрифугируйте при 3 500 x g в течение 5 минут, удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
   5. Перелейте еще 5 мл горячей суспензии и добавьте к промытым шарикам, долейте еще воды DI, хорошо перемешайте и снова центрифугируйте. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока не будет использовано около 50 мл воды DI, что в общей сложности составит от 4 до 5 раз для стирки.
   6. Переложите суспензию в бусины во флакон объемом 1 мл. Повторите промывку бусин метанолом (Список материалов) центрифугированием при 17 000 х г в течение 5 минут 3 раза, и, наконец, снова суспендируйте бусины в 1 мл 100% метанола.
2. Тиолирование поверхности валика
   1. В центрифужную пробирку объемом 50 мл добавляют 45,6 мл метанола, 0,4 мл уксусной кислоты (Перечень материалов), 1,85 мл воды DI, 1,15 мл 3-меркаптопропилтриметоксисилана (МПТМС) (Перечень материалов) и 1 мл гранул суспензии, приготовленной в 2,1 мл, затем инкубируют при РТ в течение 3 ч.
   2. После реакции удалите все реагенты, промыв их один раз свежим метанолом, и повторно суспендируйте гранулы в 500 мкл метанола. Равномерно разделите эту концентрированную суспензию на набор из 20 сухих и чистых стеклянных флаконов с завинчивающимися крышками. Испарите метанол с помощью струи сухого аргона и медленно вращайте флаконы так, чтобы на стенках каждого флакона образовался тонкий слой сухих шариков.
   3. Поместите флаконы с шариками в предварительно разогретую сушильную печь до 120 °C на 5 минут, а затем выньте и быстро наденьте крышку (крышки). Поместите флаконы в стеклянный вакуумный эксикатор, наполненный влагопоглотителями на дно, и вакуумируйте эксикатор вакуумным насосом до полного остывания.
   4. Продуйте вакуумированный эксикатор сухим аргоном, чтобы довести эксикатор до нормального атмосферного давления. Снимите крышку эксикатора и быстро снова затяните колпачк(и) на флаконе. Запечатайте флаконы пластиковой парафиновой пленкой и храните их при температуре RT в сухом темном ящике для хранения.
   5. При немедленном использовании возьмите один флакон сухих шариков и промойте один раз фосфатным буфером (список материалов), повторно суспендируйте в 50 мкл фосфатного буфера и храните при температуре 4 °C. На следующих этапах это приготовление концентрированных шариков будет называться «шариками MPTMS».
      заметка: При правильном хранении бусины MPTMS могут оставаться функциональными до трех месяцев.

3. Функционализация бусин

1. Ковалентное покрытие белков на бусинах
   1. Возьмите определенный объем (например, 2,5 мкл) белкового запаса и смешайте его с равным объемом буфера карбонат/бикарбонат, чтобы получить раствор 1,<бр/> заметка: Объем зависит от концентрации притока и желаемой конечной плотности расположения белка на поверхности шариков.
   2. В маленьком стакане взвесьте 2-3 мг линкера MAL-PEG3500-NHS (список материалов) и растворите его с карбонатно-бикарбонатным буфером до достижения конечной концентрации 0,231 мг/мл.
   3. Смешайте раствор 1 с равным объемом раствора линкера, приготовленного в. 3.1.2. Инкубируйте смесь при RT в течение 30 минут, чтобы получить раствор 2.
   4. Тем временем поместите флакон с линкером с ослабленной крышкой в стеклянный вакуумный эксикатор, заполненный влагопоглотителем на дно, и пропылесосьте 5 мин, а затем заполните эксикатор аргоном. Затяните крышку и выньте бутылку. Запечатайте бутылку пластиковой парафиновой пленкой, поместите ее в емкость, наполненную влагопоглотителями на дне, и храните при температуре -20 °C.<бр/> заметка: Шаги, связанные с использованием линкера MAL-PEG3500-NHS, включая 3.1.2-3.1.4 (за исключением инкубации в 3.1.3), должны быть выполнены как можно быстрее.
   5. Смешайте 5 мкл гранул MPTMS с раствором 2 и добавьте фосфатный буфер (список материалов), чтобы получить итоговый объем 250 мкл.
   6. Инкубируйте шарики в течение ночи при RT, 3 раза промойте фосфатным буфером и повторно суспендируйте в 100 мкл фосфатного буфера и храните при температуре 4 °C.
2. Приготовление гранул, покрытых белком/стрептавидином (SA)
   1. Следуйте протоколу 3.1.1-3.1.4.
   2. Смешайте 5 μл гранул MPTMS с раствором 2 и 5 μл 4 мг/мл раствора стрептавидин-малеимида (SA-MAL) (Список материалов), а затем добавьте фосфатный буфер, чтобы получить окончательный объем 250 μл.
   3. Инкубируйте шарики в течение ночи при RT, промойте 3 раза фосфатным буфером и, наконец, повторно суспендируйте в 100 μл фосфатного буфера и храните при 4 °C.
3. Нанесение стрептавидина на стеклянные шарики
   1. Смешайте 5 μл гранул MPTMS с 5 μл 4 мг/мл раствора SA и добавьте 140 μл фосфатного буфера.
   2. Инкубируйте шарики в течение ночи при RT, 3 раза промойте фосфатным буфером, повторно суспендируйте в 50 мкл фосфатного буфера и храните при температуре 4 °C.
4. Покрытие гранул SA биотинилированным белком
   1. Смешайте 5 μл гранул, покрытых SA, с белком (объем зависит от желаемой плотности покрытия) и добавьте фосфатный буфер, чтобы конечный объем составил 100 μл.
   2. Смесь инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C или в течение 3 часов при RT, 3 раза промыть фосфатным буфером, повторно суспендировать в 50 мкл фосфатного буфера и хранить при температуре 4 °C.

4. Подготовка клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы очистить клетки, следуйте стандартным протоколам очистки клеток, соответствующим типу используемых клеток, например, Т-клетки или определенные клеточные линии.

1. Для экспериментов fBFP, после приготовления клеточной суспензии, добавьте в клеточную суспензию Fura2-AM (список материалов), растворенный в ДМСО, до конечной концентрации 2 мкМ, инкубируйте в течение 30 минут при RT, а затем промойте один раз. Храните эту флуоресцентно нагруженную клеточную суспензию в темноте до использования.

5. Подготовка к микропипеткам и камере для клеток

1. Подготовка микропипеток
   1. Разрежьте длинные трубки из капиллярного стекла (список материалов) с помощью стеклореза на короткие кусочки длиной около 3 дюймов. Установите одну деталь на съемник микропипеток (список материалов), нажмите кнопку «Потянуть», чтобы середина капилляра нагревалась машиной, а капилляр был натянут на два конца, чтобы сделать два капилляра с острыми кончиками (необработанные микропипетки).
      заметка: Следуя рекомендациям по продукту, желаемая морфология необработанного пипетки имеет конус 6-8 мм и наконечник 0,1-0,5 мкм.
   2. Установите необработанный пипетку на держатель пипетки кузницы для микропипеток (список материалов). Тепло расплавить стеклянную сферу на горне. Вставьте кончик необработанной пипетки внутрь стеклянной сферы. Охладите стеклянную сферу и потяните за необработанную пипетку, чтобы разбить ее снаружи и оставить ее кончик внутри сферы. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока не будет получено желаемое отверстие для наконечника.
      заметка: Примеры внутреннего диаметра наконечника микропипетки: 2,0-2,4 мкм для эритроцита, ~1,5 мкм для шарика, ~2-4 мкм для Т-клетки и -7 мкм для гибридомной клетки.
2. Создание камеры камеры
   ПРИМЕЧАНИЕ: камера ячейки построена на основе самодельного держателя камеры, который состоит из двух кусков металлических квадратов (медь/алюминий) и ручки, которая связывает их между собой (рисунок 1D).
3. Разрежьте покровное стекло размером 40 мм x 22 мм x 0,2 мм с помощью стеклореза на две части размером 40 мм x 11 мм x 0,2 мм (покровные стекла 1 и 2). Приклейте покровное стекло 1 с помощью смазки к верхней стороне держателя камеры таким образом, чтобы он соединял два металлических квадрата, и аналогичным образом приклейте покровное стекло 2 к нижней стороне, что образует параллельную камеру ячейки покровного стекла (рисунок 1D).
4. С помощью пипетки введите 200 мкл экспериментального буфера между двумя покровными стеклами. Убедитесь, что буфер прикреплен к обоим покровным стеклам. Осторожно поверните и встряхните камеру, чтобы буфер коснулся обоих концов камеры.
5. Осторожно впрыскивайте минеральное масло с обеих сторон камеры, обойдя экспериментальную буферную зону, тем самым изолируя буфер от открытого воздуха. Вводите суспензии зондовых шариков (например, гранул с покрытием pMHC), эритроцитов и мишеней (например, Т-клеток) в верхнюю, среднюю и нижнюю области буферной зоны соответственно.

4. Эксперимент BFP

1. Включите микроскоп (Список материалов) и источник света. Поместите камеру на основной предметный столик микроскопа (рис. 1A, D).
2. Установите все три микропипетки BFP (Рисунок 1D. Слева: зонд, чтобы схватить эритроцит, справа: мишень, чтобы схватить клетку или бусину, внизу справа: помощник, чтобы схватить бусину).
   1. Используйте микроинъектор (список материалов) для заполнения микропипетки экспериментальным буфером. Снимите держатель пипетки (Список материалов) и держите его в более низком месте, чтобы вода могла капать с наконечника. Быстро вставьте микропипетку в наконечник держателя и убедитесь, что во время введения в микропипетку не попадут пузырьки воздуха. Затяните винт держателя.
   2. Установите каждый держатель пипетки на соответствующий микроманипулятор. Подтолкните микропипетку к камере так, чтобы их кончики вошли в буферную зону камеры. Отрегулируйте положение микропипеток и найдите их под полем зрения микроскопа.
3. Перемещайтесь по ступеням держателя камеры, чтобы найти колонии трех элементов (эритроцитов, мишеней и бусин зонда) один за другим. Отрегулируйте положение соответствующей микропипетки, поворачивая ручки манипуляторов так, чтобы кончик микропипетки приблизился на одну клетку/шарик. Аспирируйте клетку/шарик, регулируя давление внутри соответствующей микропипетки. Все три микропипетки будут захватывать соответствующие элементы.
4. Перемещайтесь вокруг ступеней держателя камеры, чтобы найти открытое пространство вдали от колоний вводимых элементов, где будет проводиться эксперимент. Переключите визуальный режим микроскопа для визуализации изображения в компьютерной программе на экране компьютера. Переместите все три элемента на наконечниках пипеток в поле зрения программы.
5. Совместите валик щупа и эритроциты и осторожно переместите бусину щупа к вершине эритроцита, кратковременно прижмите бусину к эритроцитам и осторожно втяните. Отрегулируйте давление вспомогательной микропипетки, чтобы аккуратно сдуть шарик, чтобы она осталась приклеенной к верхушке эритроцитов (Рисунок 1F). Отодвиньте вспомогательную микропипетку и совместите мишень и бусину зонда (рисунок 2A).
6. В программе в окне поля зрения используйте инструменты программы для измерения соответствующих радиусов зондовой микропипетки (Rp), эритроцита (R0), круговой зоны контакта между эритроцитом и зондовым шариком (Rc), что позволяет оценить пружинную постоянную эритроцита (k) по следующему уравнению, где Δp - давление аспирации на наконечнике зондовой пипетки. Примечание: Из закона Гука следует, что связывающая сила, F, может быть количественно определена как произведение постоянной пружины и смещения шарика зонда (d), т.е. F = d (рис. 2C).
   
7. Введите в программу желаемую пружинную константу эритроцитов (см. раздел протокола 4.6. Пружинная постоянная обычно устанавливается на уровне 0,25 или 0,3 пН/нм для анализа силового зажима и анализа частоты адгезии и 0,1 пН/нм для анализа тепловых колебаний), что возвращает требуемое давление аспирации в единицу сантиметра воды. Отрегулируйте высоту резервуара для воды, который соединяется с пипеткой зонда, пока не будет достигнуто требуемое давление аспирации.
8. Нарисуйте горизонтальную линию поперек вершины эритроцита, в результате чего в соседнем окне появится кривая, указывающая яркость (значение оттенков серого) каждого пикселя вдоль этой линии. Перетащите пороговую линию примерно на половину глубины кривой (рис. 2A, B).
   заметка: Минимальная точка на кривой яркости ниже пороговой линии указывает на положение границы бусины, таким образом, допускается только один локальный минимум. Если в настоящее время есть два или более локальных минимума, это указывает на то, что изображение не является оптимальным (вероятно, из-за того, что изображение не в фокусе или из-за плохого выравнивания между пробником и эритроцитами).
9. Выберите нужный режим эксперимента: анализ тепловых флуктуаций, анализ частоты адгезии или силовой зажимной анализ. Установите желаемые параметры (например, сила соударения = 15 пН, скорость нагрузки = 1 000 пН/с, время контакта = 1 сек, усилие зажима = 20 пН (для анализа силы зажима) и т. д.).
   1. Нажмите «Пуск», чтобы программа могла перемещать пипетку-мишень и вводить мишень в контакт с зондом и из него (подробнее см. раздел «Репрезентативные результаты»). Параллельно будет производиться сбор данных, который фиксирует положение щупа в режиме реального времени. Остановите программу, нажав на кнопку «Остановить эксперимент», после чего появится окно, позволяющее сохранить полученные данные.

Результаты

Рисунок 1: Сборка fBFP.

(A) Обзорная картинка аппаратной системы fBFP. (B) Схематический чертеж аппаратной системы fBFP. (C) Двухкулачковая система "DC2" (оранжевая), на которую были установлены высокоскоростная камера (синяя) и флуоресцентная камера (белая). (D) Предметный столик для микроскопа, который ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Моноосновной моногидрат фосфата натрия (NaH2PO4 • H2O)	Сигма-Олдрич	С9638	Приготовление фосфатного буфера
Анхи. Двухконтурный фосфат натрия (Na2HPO4)	Сигма-Олдрич	С7907	Приготовление фосфатного буфера
Карбонат натрия (Na2CO3)	Сигма-Олдрич	С2127	Приготовление карбонатного/бикарбонатного буфера
Бикарбонат натрия (NaHCO3)	Сигма-Олдрич	С5761	Приготовление карбонатного/бикарбонатного буфера
Хлорид натрия (NaCl)	Сигма-Олдрич	С7653	Приготовление буфера N2-5%
Хлорид калия (KCl)	Сигма-Олдрич	П9541	Приготовление буфера N2-5%
Калийфосфат одноосновной (KH2PO4)	Сигма-Олдрич	П5655	Приготовление буфера N2-5%
сахароза	Сигма-Олдрич	С0389	Приготовление буфера N2-5%
MAL-PEG3500-NHS	ДженКем	А5002-1	Функционализация швов
Биотин-PEG3500-НСЗ	ДженКем	А5026-1	Биотинилирование эритроцитов
Нистатин	Сигма-Олдрич	Н6261	Корректировка осмолярности эритроцитов
Гидроксид аммония (NH4OH)	Сигма-Олдрич	А-6899	Силанизация стеклянных шариков
метанол	BDH	Тел.: 67-56-1 (английский	Силанизация стеклянных шариков
30% перекись водорода (H2O2)	Джей Ти Баркер	Янв-86	Силанизация стеклянных шариков
Уксусная кислота (ледяная)	Сигма-Олдрич	ARK2183	Силанизация стеклянных шариков
3-Меркаптопропилтриметоксисилан (МПТМС)	ООО «Укт Специализация»	4420-74-0	Функционализация стеклянных шариков
Бусины из боросиликатного стекла	Технология частиц Distrilab	9002	Функционализация стеклянных шариков
Стрептавидин-малеимид	Сигма-Олдрич	С9415	Функционализация стеклянных шариков
БСА	Сигма-Олдрич	А0336	Функционализация лиганда
Фура2-АМ	Технологии Life	Ф-1201	Внутриклеточная нагрузка флуоресцентным краителем кальция
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Сигма-Олдрич	Д2650	Внутриклеточная нагрузка флуоресцентным краителем кальция
Quantibrite PE Бусины	BD Biosciences	340495	Количественное определение плотности
Капиллярная трубка 0,7-1,0 мм х 30 дюймов	Кимбл Чейз	46485-1	Изготовление микропипеток
Пылающий/коричневый пуллер для микропипеток	Инструмент Саттера	-97	Изготовление микропипеток
Нарисигэ	Нарисигэ	Нарисигэ	Изготовление микропипеток
нефтепродукт	Научный центр Фишера	БП2629-1	Камерный монтаж
Защитное стекло микроскопа	Научный центр Фишера	12-544-Г	Камерный монтаж
Микроинъектор	Мировые прецизионные приборы	МФ34Г-5	Камерный монтаж
1 мл шприц	БД	309602	Камерный монтаж
Держатель для микропипеток	Нарисигэ	HI-7	Камерный монтаж
Микроскоп (инвертированный TiE)	Компания Nikon	MEA53100	Система BFP
Объектив CFI Plan Fluor 40x (NA 0,75, WD 0,72 мм, Spg)	Компания Nikon	MRH00401	Система BFP
Камера, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" ПЗС-матрица, монохромная	Визуализация Graftek	02-2020С	Система BFP
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, моно., ПЗС, 12-разрядный АЦП	Визуализация Graftek	02-2185А	Система BFP
Ручная субмикронная головка зонда с дистанционным управлением с высоким разрешением	Карл Зюсс	РН400	Система BFP
Антивибрационный стол (5' x 3')	ТМС	77049089	Система BFP
3D ручная трансляционная стадия	Ньюпорт	462-XYZ-М
Программное обеспечение SolidWorks 3D CAD	Программное обеспечение SolidWorks 3D CAD	Версия 2012 SP5	Система BFP
Программное обеспечение LabVIEW	Национальные инструменты	Версия 2009	Система BFP, программа BFP
3D пьезотрансляционный столик	Physik Instrumente	М-105.3П	Система BFP
Линейный пьезоаккумулятор	Physik Instrumente	-753.1КД	Система BFP
Карбонатный/бикарбонатный буфер (pH 8,5)			8,4 г/л карбоната натрия (Na2CO3), 10,6 г/л бикарбоната натрия (NaHCO3)
N2-5% буфер (pH 7,2)			27,6 г/л одноосновного NaPhosphate (NaH2PO4 • H2O), 28,4 г/л Anhy. Двухосновной NaPhosphate (Na2HPO4)
			20,77 г/л хлорида калия (KCl), 2,38 г/л натрия хлорида (NaCl), 0,13 г/л одноосновного калийфосфата (KH2PO4), 0,71 г/л натрия фосфата двухосновного (Na2HPO4), 9,70 г/л сахарозы