$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Очистка GTPase с тегом GST
- Культивирование штамма E. coli, такого как BL21, трансформировали с помощью pGEX-Rac1 O/N при 37 °C, встряхивая при 220 об/мин, в 500 мл автоиндукционной среды (25 мМ Na2HPO4, 25 мМ KH2PO4, 50 мМ NH4Cl, 5 мМ Na2SO4, 2 мМ MgSO4, 2 мМ CaCl2, 0,5% глицерина, 0,05% глюкозы, 0,2% лактозы, 5 г триптона, 2,5 г дрожжевого экстракта, 100 мкг/мл ампициллина).
- Соберите бактерии центрифугированием в течение 10 минут при температуре 10 000 x g, 4 °C.
- Суспендируйте бактериальную гранулу в 20 мл реагента для экстракции белка, 1x ингибитора протеазы, и инкубируйте в течение 20 минут в RT с инверсией.
- Осветите лизат центрифугированием при 40 000 x g в течение 30 минут.
- Добавьте 2 мл магнитных шариков глутатиона, промытых фосфатно-соевым буфером (PBS: 10 мМ Na2HPO4, 1,8 мМ KH2PO4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl).
- Инкубировать в течение 2 часов, перемешивая путем инверсии при 4 °C.
- Промойте гранулы с белком четыре раза с помощью 10 мл PBS, используя магнитный сортировщик частиц, чтобы осаждать бусины на каждом этапе.
- Суспендируйте гранулы, богатые белком, в 2 мл PBS и храните при -80 °C в 100 мкл аликвот до тех пор, пока они не понадобятся.
2. Экспрессия белков, связывающих ГТФазу
- За день до эксперимента трансфектировали плазмиды, кодирующие помеченные зеленым флуоресцентным белком (GFP) версии каждого белка, связывающего ГТФазу, в отдельную колбу размером 75 см2 HEK293T следующим образом. Для валидации загрузки нуклеотидов трансфектируйте GFP-меченный TrioD1 в третью колбу размером75 см 2 HEK293T.
- Разведите полиэтиламин до 1 мг/мл в 100 мкл стерильного 150 мМ NaCl.
- Добавьте 27 мкл разведенного полиэтилениламина к 223 мкл восстановленной сывороточной среды.
- Добавьте 12 г плазмидной ДНК к 250 μл восстановленной сывороточной среды.
- Инкубируйте каждую пробирку в течение 2 минут при RT.
- Соедините смеси полиэтилениламина и ДНК в одной пробирке и смешайте с вортексом в течение 2 минут.
- Инкубировать в течение 15-20 мин при RT.
- Замените питательную среду (модифицированную среду Dulbecco's Modified Eagle Media, 10% фетальную бычью сыворотку, 2 мл L-глютамина, без антибиотиков) на 90% конфлюентную HEK293T 5 мл свежей питательной среды.
- Добавьте в колбу комбинированную смесь полиэтилениламина и ДНК и инкубируйте O/N при 37 °C, 5%CO2.
3. Очистка белков, связывающих ГТФазу
- Промыть колбы с трансфицированными клетками в PBS и слить воду из колбы в течение 5 мин, отсасывая свободную жидкость.
- Соскребите клетки в буфере для лизиса объемом 500 мкл (50 мМ Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x ингибитор протеазы) в микрофугальную пробирку.
- Лизировать клетки путем перемешивания путем инверсии при 4 °C в течение 30 мин.
- Во время лизиса промойте две партии шариков GFP-Trap по 40 мкл три раза свежим буфером для лизиса, осаждая шарики в концентрации 2 700 x g в течение 2 минут между промывками.
- Осветлить лизаты центрифугированием при температуре 21 000 x g в течение 10 минут.
- Перенесите осветленный лизат каждого из конкурирующих белков на отдельные промытые шарики GFP-ловушки и дайте белкам GFP-слияния связываться в течение 2 часов, перемешивая путем инверсии при 4 °C. Храните лизат из клеток GFP-TrioD1 на льду.
- Дважды промыть гранулы GFP-Trap в 50 мМ Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (w/v) Nonidet P-40 и дважды в 50 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2, осаждение гранул при 2 700 x g в течение 2 минут между промывками.
- Разбавьте гибридные белки GFP, добавив 40 мкл 0,2 М глицина (pH 2,5) и пипетируя вверх и вниз в течение 30 с. Немедленно осадите шарики при концентрации 21 000 x g в течение 60 с и перенесите жидкость в новую микропробирку, содержащую 4 мкл 1 М Tris-HCl (pH 10,4). Делайте это быстро, чтобы ограничить повреждение очищенного белка.
- Проанализируйте 1 мкл каждого очищенного белка с помощью вестерн-блоттинга и зондируйте антителом против GFP для определения относительного выхода с использованием системы количественного блоттинга в соответствии с протоколом производителя. В качестве альтернативы можно определить концентрацию белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (ВСЦ), но это приводит к ошибкам, если белки не реагируют с анализом идентичным образом или если есть загрязняющие белки.
- Выравнивают концентрацию молярного белка путем добавления 50 мМ Tris-HCl (pH 7,6) и 20 mM MgCl2.
4. Нуклеотидная загрузка ГТФазы
- Разморозьте одну аликвоту магнитных шариков GST-Rac1, приготовленных на шаге 1.
- Возьмите 90 мкл гранул GST-Rac1 и трижды промойте 20 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 25 мМ NaCl, 0,1 мМ DTT и 4 мМ EDTA, используя магнитопорошковый сортировщик для осаждения гранул на каждом этапе.
- Аспиратируйте буфер из гранул и добавьте 100 мкл 20 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 25 мМ NaCl, 0,1 мМ DTT и 4 мМ ЭДТА.
- В зависимости от того, требуется ли для проведения эксперимента ВВП, ГТФ или ее отсутствие, добавьте 12 мкл 100 мМ ВВП, 12 мкл 10 мМ гуанозина 5'-[γ-тио]трифосфата (ГТФγS) или его отсутствие
.
- Для контроля загрузки нуклеотидов разделите оставшиеся шарики на три аликвоты по 10 мкл и добавьте 2 мкл 100 мМ GDP, 2 мкл 10 мМ GTPγS или без нуклеотидов в каждую пробирку.
- Инкубировать смеси шариков в течение 30 минут при температуре 30 °C с перемешиванием.
- Стабилизируют связанный с нуклеотидами Rac1 путем добавления 1 M MgCl2: 3 мкл в экспериментальную смесь (шаг 4.4) и 0,5 мкл в каждую из контрольных смесей (шаг 4.5).
5. Привязка к соревнованиям
- Установите 6 пробирок с микрофугами, каждая из которых содержит:
200 мкл 50 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 20 мМ MgCl2
10 мкл экспериментальных нуклеотидных шариков Rac1 (с шага 4.7)
5 мкл Rac1-связывающего белка A (постоянный связывающий белок)
- В каждую пробирку добавьте 0, 1, 2,5, 5, 10 или 20 мкл Rac1-связывающего белка B (вариабельный связывающий белок). Эти объемы предполагают примерно равные исходные концентрации постоянных и переменных связывающих белков и, возможно, потребуется скорректировать.
- Отрегулируйте объемы связывающих белков А и В, если существуют большие различия в аффинитете связывания двух белков, и это должно быть определено эмпирически с помощью экспериментальных повторов. Составить общий объем связующей смеси до 235 мкл путем добавления 50 мМ Tris-HCl (pH 7,6) и 20 mM MgCl2.
- Установите пробирку для микрофуги, содержащую:
200 мкл 50 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 20 мМ MgCl2
10 мкл экспериментальных нуклеотидных шариков Rac1 (с шага 4.7)
10 мкл Rac1-связывающего белка A (постоянный связывающий белок)
- Настройте GDP, GTPγS и без нуклеотидных контрольных трубок:
200 мкл 50 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 20 мМ MgCl2
10 мкл контрольных шариков Rac1, загруженных на этапе 4.5 с GDP, GTPγS или без нуклеотидов и стабилизированных на этапе 4.7.
180 мкл HEK293T лизата GFP-TrioD1, полученного как на стадии 3,6<бр/>
4 μл 1 М MgCl2
- Инкубировать смесь в течение 2 часов, перемешивая путем инверсии при 4 °C.
- Промойте шарики три раза 50 мМ Tris-HCl (pH 7,6) и 20 mM MgCl2.
- Элюирующие связанные белки в буфере для проб объемом 20 мкл (50 мМ Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% глицерин, 0,02 мг/мл бромфенола синего, 5% β-меркаптоэтанол).