Микрочип вирусного антигена для выявления изотипов антител в сыворотке крови против вирусного антигена

Аннотация

Источник: Khan, S., et al., Использование микрочипа антигена гриппа для измерения широты сывороточных антител по подтипам вируса. J. vis. Exp. (2019)

В этом видео мы демонстрируем процесс обнаружения изотипов антител в нескольких образцах сыворотки крови человека с помощью слайда микрочипа, напечатанного с антигенными подтипами штаммов вируса гриппа.

Протокол

1. Производство микрочипов антигена гриппа

1. Печать антигенов на предметных стеклах микрочипов
   1. Восстановите каждый лиофилизированный антиген до концентрации 0,1 мг/мл в фосфатно-солевом буфере (PBS) с 0,001% Tween-20 (T-PBS). Перенесите 10 μL каждого восстановленного антигена в отдельные лунки необработанного 384-луночного планшета с плоским дном.
   2. Печать антигенов с помощью микрочипового принтера с малообъемными микрочиповыми пятнистыми штифтами, которые аспирируют антиген в канал образца и наносят его путем прямого контакта и капиллярного действия на стеклянные стекла с 16-слойным нитроцеллюлозным покрытием.
      1. Запрограммируйте программное обеспечение для печати (например, Gridder) с конфигурацией исходной формы и параметрами печати.
         1. С помощью раскрывающегося меню выберите название типа пластины, которая будет использоваться при данном способе печати. Для этого исследования используйте необработанную 384-луночную пластину с плоским дном.
         2. Выберите текстовое поле рядом с полем «Количество пластин» и введите количество образцов пластин, которые будут использоваться в этом протоколе печати. Для этого исследования используйте 1 пластину.
         3. Выберите конфигурацию выводов для использования с этим методом. Для этого исследования используйте конфигурацию с 8 контактами.
         4. Убедитесь, что смещения начала координат — это расстояния (в направлениях X и Y) между началом координат слайда (которое откалибровано в разделе «Администрирование») и местом, где печатающие булавки начнут печатать на слайдах.
         5. На вкладке Array Design (Проектирование массива) определите размер и форму массивов (расстояние между точками и количество точек в подмассиве). Для этого исследования напечатайте 324 пятна (диаметр 180 мкм с шагом 300 мкм) на 16 слайдах в формате 18x18 с помощью 8 контактов.
         6. Выберите параметры, определяющие, как печатающие булавки захватывают и дозируют образцы. В этом исследовании каждый контакт аспирирует 250 нл раствора антигена и печатает по 1 нл на каждое из 40 пятен (всего 20 слайдов для всех 8 контактов)
         7. Настройте протокол очистки контактов и протокол блоттинга. Для этого исследования каждый отпечаток антигена погружают в стерильный ddH₂O в промывочный контейнер с ультразвуком, а затем аспирируют следующий антиген.
         8. Определите последовательность, в которой образцы блоков печатаются на слайдах. Программное обеспечение массива создаст аннотированный файл индекса сетки (.gal) для описания расположения антигенов в каждом микрочипе.
            заметка: Верхний ряд используется для реперных точек (с флуоресценцией на всех длинах волн, используемых в визуализации, например, смесь конъюгата стрептавидина Qdot 585 нм и конъюгата стрептавидина Qdot 800 нм в этом исследовании) для ориентации сеток во время визуализации. При больших тиражах антигены в исходной пластине могут периодически повторно суспендироваться путем пипетирования вверх и вниз, а затем центрифугирования, или можно подготовить и использовать новую исходную пластину.
   3. Поместите непроверенные предметные стекла микрочипа в светонепроницаемый бокс и храните их в шкафу с эксикатором при комнатной температуре для длительного хранения.
      заметка: На этом этапе протокол может быть приостановлен на неопределенный срок.
2. Выполнение проверки контроля качества (требуются полигистидиновые метки)
   1. Прикрепите предметное стекло к зондирующим камерам и регидратируйте с помощью блокирующего буфера, как описано в шагах 2.1.1-2.1.2 и показано на рисунке 1.
   2. Разведите мышиное моноклональное антитело поли-Гис 1:100 в отфильтрованном 1x блокирующем буфере.
      заметка: Если неочищенные белковые антигены (например, экспрессируемые в системе транскрипции и трансляции in vitro) непосредственно используются для печати микрочипов, добавьте компоненты системы экспрессии белка (например, лизат E. coli) в соотношении 1:10 с блокирующим буфером, используемым для разведения сыворотки, чтобы блокировать любые антитела, направленные против этих компонентов.
   3. Добавьте 100 мкл разбавленного антитела poly-His в каждую слайд-камеру, содержащую матрицу, после аспирации и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C на шейкере. Промойте 3 раза буфером T-TBS, как описано в шаге 2.2.1. Разведите биотин-конъюгированное вторичное антитело козьего антимышиного IgG 1:200 в блокирующем буфере, добавьте 100 мкл в лунку после аспирации и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре в шейкере. Промойте 3 раза с буфером T-TBS.
   4. Разведите конъюгат стрептавидина Qdot 585 нм до 4 нМ в блокирующем буфере, добавьте 100 мкл в лунку после аспирации и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре в шейкере. Промойте 3 раза с буфером T-TBS, а затем один раз с буфером TBS (без Tween).
   5. Разберите и количественно оцените слайды, как описано в шагах 2.2.5 – 3.1.2.
      заметка: Белковые антигены должны содержать метки His10 для использования этого протокола контроля качества. В качестве альтернативы, если включена другая метка, может быть проведена проверка контроля качества с антителом или лигандом для этой метки.

2. Зондирование сывороток на антитела к гриппу с помощью микрочипов

1. Инкубируйте сыворотки на микрочипах для связывания антител.
   1. Прикрепите предметные стекла микрочипов к камерам с помощью зажимов и поместите их в рамки, как показано на рисунке 2.
      заметка: Всегда избегайте прикосновения к площадке микрочипа руками и инструментами. Убедитесь, что слайды ориентированы подушечкой вверх и имеют маленькую выемку в правом верхнем углу.
   2. Регидратируйте предметные стекла микрочипов 100 мкл на лунку отфильтрованного 1x блокирующего буфера и разведите сыворотку 1:100 в 100 мкл блокирующего буфера (можно использовать необработанные 96-луночные планшеты или 2 мл пробирки). Инкубируйте оба регидратированных предметных стекла микрочипа в закрытых рамках и разведенные сыворотки отдельно в течение 30 минут при комнатной температуре на орбитальном вибростенде со скоростью 100-250 об/мин. Выполняйте все последующие этапы инкубации аналогично на шейкере.
      заметка: Сыворотки должны быть аликвотированы и заморожены при температуре -80 °C для длительного хранения, чтобы свести к минимуму циклы замораживания-оттаивания, а также должны быть обработаны вихревым потоком для смешивания и центрифугирования для удаления твердых частиц перед использованием. Внимательно наблюдайте за шиберными камерами во время и после этого шага, чтобы обнаружить любые утечки, требующие повторной сборки шиберных камер.
   3. С помощью наконечников для дозатора, подключенных к вакуумной линии с колбой вторичного сбора, осторожно отсасывайте блокирующий буфер из угла каждой камеры, не касаясь прокладок. Выполняйте все последующие шаги аспирации аналогично. Добавляйте разведенные сыворотки в прокладки быстро после аспирации, чтобы не допустить высыхания прокладок.
   4. Поместите закрытые рамки в лотки внутрь вторичного контейнера, окруженного влажными бумажными полотенцами и закрытого для предотвращения испарения. Инкубировать в течение ночи при 4 °C на качающемся шейкере (в качестве альтернативы можно инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере со скоростью 100-250 об/мин).
2. Антитела сыворотки, связанные меткой с вторичными антителами, конъюгированными с квантовыми точками
   1. Тщательно отсадите сыворотки из камер, как описано выше, добавьте 100 мкл буфера T-TBS на лунку (20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 0,05% Tween-20 в ddH₂O, отрегулированном до pH 7,5 и отфильтрованном, можно получить в промышленных масштабах) и инкубируйте в течение 5 мин на орбитальном шейкере при 100-250 об/мин. Повторите этот шаг промывки в общей сложности 3 раза (все последующие этапы промывки выполняются аналогично).
   2. Приготовьте смесь вторичных антител, разведенных до 1 мкМ в блокирующем буфере, и тщательно перемешайте с помощью пипетирования до и во время использования для поддержания однородности.
      заметка: Для обеспечения воспроизводимости анализа следует использовать одну и ту же партию каждого вторичного антитела для всех зондирующих экспериментов, для которых планируется количественное сравнение данных из разных экспериментов. Специфическая концентрация вторичного антитела может варьироваться в зависимости от аффинности; Следуйте протоколам производителя, если это возможно.
   3. Аспират буфера из камер после окончательной промывки добавьте 100 мкл на лунку смеси вторичных антител и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре на шейкере.
   4. Смесь аспиратных вторичных антител промойте 3 раза буфером T-TBS, а затем промойте один раз буфером TBS (без Tween).
   5. Осторожно извлеките предметные стекла микрочипов из камер, чтобы не прикасаться к подушечкам, аккуратно промойте отфильтрованным ddH₂O и высушите, поместив их в пробирки объемом 50 мл и центрифугируя при 500 x g в течение 10 минут.
   6. Поместите предметные стекла для микрочипов в светонепроницаемый бокс и храните их в шкафу с эксикатором при комнатной температуре для длительного хранения.
      заметка: На этом этапе протокол может быть приостановлен на срок до 1 недели.

3. Количественное определение связывания антител с антигенами в микрочипе

1. Визуализируйте слайды микрочипов и количественно оценивайте интенсивность флуоресценции пятен для измерения связывания антител.
   1. Получение изображений слайдов микрочипов с помощью портативного имидж-сканера со встроенным программным обеспечением.
      1. На вкладке Настроить имидж-сканер выберите подходящую конфигурацию слайда. Для этого исследования используйте слайды с 16 подушечками.
      2. На вкладке Управление изображением выберите подходящий флуоресцентный канал и отрегулируйте усиление, время экспозиции и время сбора данных в зависимости от реакционной способности сывороток для получения оптимальных изображений. В этом исследовании флуоресцентные каналы для IgA и IgG составляли 585 нм и 800 нм соответственно, а настройки визуализации составляли усиление 50, время экспозиции 500 мс и время сбора данных 1 с.
      3. Нажмите на кнопку Захват, чтобы начать процесс получения изображения.
         заметка: Слайды микрочипов могут быть повторно визуализированы в различных условиях без ухудшения качества сигналов, если они хранятся в темном и сухом тоне. Можно использовать и другие системы визуализации, совместимые со слайдами.
2. Обнаруживайте пятна массива с помощью сетки, ориентированной на основе реперных маркеров, и измеряйте интенсивность пятна как медиану интенсивности пикселей минус фон, измеренный вокруг точек. Выполните этот алгоритм количественной оценки в пакетном режиме с помощью встроенного программного обеспечения для формирования изображений, которое использует файл .gal, созданный на шаге 1.1.2, для подключения интенсивности пятен к отдельным антигенам на каждом микрочипе.
   1. На панели «Информация о файле» загрузите файл .gal, выбрав его из папки на компьютере, и укажите папку, в которой будут сохранены выходные файлы анализа, в разделе «Параметры анализа».
   2. На вкладке «Управление изображением» откройте одно из полученных изображений, подлежащих количественной оценке, и нажмите кнопку «Авто» в правом верхнем углу.
   3. В разделе «Анализ массивов» в правом нижнем углу создайте реперный шаблон в соответствии с инструкциями программного обеспечения.
   4. Нажмите на кнопку «Пакетный анализ», выберите папку, содержащую изображения, которые необходимо количественно оценить, и выберите реперный шаблон, созданный на предыдущем шаге. Программное обеспечение анализирует каждое изображение и количественно определяет интенсивность пятна.
      заметка: На этом этапе будет сгенерирован файл .csv, содержащий интенсивность пятен, количественно определяющую антитела в каждом образце сыворотки, которые связываются с каждым отдельным антигеном на микрочипе, который впоследствии можно манипулировать с помощью электронных таблиц или программного обеспечения для анализа.
3. Анализируйте исходные данные для сравнения связывания антител между антигенами и образцами сыворотки. Для этого исследования антитела IgA и IgG, измеренные как интенсивность флуоресцентного пятна 585 нм и 800 нм, сравнивали по всем антигенам между 2 независимыми прогонами эксперимента с использованием разных слайдов в разные дни, и проводили корреляционный анализ для измерения воспроизводимости анализа><. заметка: Для неочищенных белков, напечатанных в виде смеси для экспрессии, анализ данных должен начинаться с вычитания фона без контроля ДНК.

Результаты

Рисунок 1: Схема протокола печати и зондирования микрочипов антигена гриппа. Слева направо микрочип печатается с использованием покрытых нитроцеллюлозой предметных стекол, которые используются для зондирования сывороток на антитела IgG и IgA с использованием вторичных антител, сопряженных с квантовыми точками, при этом слайды визуализируются с помощью портативного тепловизора, а резу...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
16-контактные стеклянные стекла с нитроцеллюлозным покрытием	Grace Bio Labs	305016
1x GVS FAST буфер блокировки	Fischer Scientific	10485356
ArrayCam	Grace Bio Labs	400S	Другие устройства визуализации могут быть использованы для визуализации слайдов, если они способны достичь разрешения пятен микрочипа, а также длин волн возбуждения и излучения квантовых точек.
биотин-конъюгированное козье антитело против мышиного IgG	Thermo Fischer
HiBase 384-луночный планшет	Greiner Bio-One
Microchip	ArrayIt	GMP2	Для каждого принтера с микрочипами могут потребоваться собственные контакты микрочипа.
Мышиное моноклональное поли-Ис-антитело	Сигма-Олдрич	H1029
OmniGrid 100	GeneMachines		Версия микрочипового принтера, использованная в этой работе, больше не доступна в продаже, но обновленным аналогичным оборудованием является микрочиповый принтер OmniGrid Accent от Digilab (Хопкинтон, штат Массачусетс), и тот же протокол может быть выполнен с большинством коммерчески доступных микрочиповых принтеров.
ProPlate	Grace Bio Labs
ProPlate скользящие зажимы	Grace Bio Labs	204838
ProPlate	Grace Bio Labs	246879
Квантовая точка 585 нм конъюгированное козье антитело к IgA человека	Grace Bio Labs
Конъюгат стрептавидина 585 нм	Thermo Fischer	Q10111MP
Квантовая точка 800 нм конъюгированное козье антитело к человеку-IgG	Grace Bio Labs