Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Выделение первичных моноцитов человека методом иммуномагнитного отрицательного отбора
- Соберите 40 мл свежей цельной человеческой крови (от пациента с ВИЧ+ или здорового человека) в четыре вакуумные пробирки по 10 мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (10 мл крови на пробирку). Используя стерильные методы под шкафом биобезопасности, перелейте все 40 мл крови в одну коническую пробирку объемом 50 мл.
- Следуя протоколу производителя для выбранного набора для выделения моноцитов человека (Таблица материалов), добавьте в пробирку с кровью 2 мл коктейля из изоляции моноцитов, входящего в комплект. Вихревые магнитные шарики, также предусмотренные в наборе, на 30 с, и добавить 2 мл в пробирку с кровью.
- Если доступно менее 40 мл крови, уменьшите количество добавляемых реагентов. Чтобы смешать раствор, пипетку вверх и вниз с помощью пластиковой серологической пипетки объемом 25 мл и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
- Разделите смесь крови поровну на четыре пробирки по 50 мл и добавьте в каждую пробирку 30 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 1 мМ ЭДТА. Перемешайте путем пипетирования вверх и вниз с помощью пластиковой серологической пипетки объемом 25 мл.
- Поместите пробирки в магнитные держатели на 10 минут, чтобы удалить магнитные шарики, сопряженные с антителами. Используйте одновременно четыре магнитодержателя, по одному на каждую пробирку, чтобы обеспечить одинаковое время инкубации и изоляции для каждого образца крови.
- Набирайте содержимое из центра каждой пробирки с помощью пипетки, пока оно еще находится в магнитных держателях. Будьте осторожны, чтобы не собрать эритроциты (не более 10% от начального объема 10 мл) и поместите содержимое в одну из четырех новых пробирок объемом 50 мл.
- Добавьте 500 мкл вихревых магнитных шариков в каждую 50 мл пробирки. Пипетку объемом 25 мл пипетку можно сделать вверх и вниз и инкубировать при температуре RT в течение 5 минут. Затем поместите пробирки в магнитные держатели на 5 минут.
- Осторожно перенесите содержимое из центра каждой пробирки, еще находясь в магнитных держателях, в одну из четырех новых пробирок объемом 50 мл. Поместите каждую новую пробирку объемом 50 мл непосредственно в держатели магнитов на 5 минут.
- Осторожно перенесите содержимое из центра каждой пробирки в одну из четырех новых пробирок объемом 50 мл. Вращайте все новые пробирки объемом 50 мл при 300 x g в течение 5 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте все четыре клеточные гранулы в общей сложности 10 мл стерильного PBS.
- Подсчет клеток методом исключения трипанового синего с помощью гемоцитометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: 8-20 x 106 клеток обычно получают из 40 мл цельной крови.
