Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Выделение первичных моноцитов человека методом иммуномагнитного отрицательного отбора
- Соберите 40 мл свежей цельной человеческой крови (от пациента с ВИЧ+ или здорового человека) в четыре вакуумные пробирки по 10 мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (10 мл крови на пробирку). Используя стерильные методы под шкафом биобезопасности, перелейте все 40 мл крови в одну коническую пробирку объемом 50 мл.
- Следуя протоколу производителя для выбранного набора для выделения моноцитов человека (Таблица материалов), добавьте в пробирку с кровью 2 мл коктейля из изоляции моноцитов, входящего в комплект. Вихревые магнитные шарики, также предусмотренные в наборе, на 30 с, и добавить 2 мл в пробирку с кровью.
- Если доступно менее 40 мл крови, уменьшите количество добавляемых реагентов. Чтобы смешать раствор, пипетку вверх и вниз с помощью пластиковой серологической пипетки объемом 25 мл и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
- Разделите смесь крови поровну на четыре пробирки по 50 мл и добавьте в каждую пробирку 30 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 1 мМ ЭДТА. Перемешайте путем пипетирования вверх и вниз с помощью пластиковой серологической пипетки объемом 25 мл.
- Поместите пробирки в магнитные держатели на 10 минут, чтобы удалить магнитные шарики, сопряженные с антителами. Используйте одновременно четыре магнитодержателя, по одному на каждую пробирку, чтобы обеспечить одинаковое время инкубации и изоляции для каждого образца крови.
- Набирайте содержимое из центра каждой пробирки с помощью пипетки, пока оно еще находится в магнитных держателях. Будьте осторожны, чтобы не собрать эритроциты (не более 10% от начального объема 10 мл) и поместите содержимое в одну из четырех новых пробирок объемом 50 мл.
- Добавьте 500 мкл вихревых магнитных шариков в каждую 50 мл пробирки. Пипетку объемом 25 мл пипетку можно сделать вверх и вниз и инкубировать при температуре RT в течение 5 минут. Затем поместите пробирки в магнитные держатели на 5 минут.
- Осторожно перенесите содержимое из центра каждой пробирки, еще находясь в магнитных держателях, в одну из четырех новых пробирок объемом 50 мл. Поместите каждую новую пробирку объемом 50 мл непосредственно в держатели магнитов на 5 минут.
- Осторожно перенесите содержимое из центра каждой пробирки в одну из четырех новых пробирок объемом 50 мл. Вращайте все новые пробирки объемом 50 мл при 300 x g в течение 5 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте все четыре клеточные гранулы в общей сложности 10 мл стерильного PBS.
- Подсчет клеток методом исключения трипанового синего с помощью гемоцитометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: 8-20 x 106 клеток обычно получают из 40 мл цельной крови.
2. Культивирование первичных моноцитов человека
- Используя водяную баню при температуре 37 °C, теплые бессывороточные среды RPMI 1640 с добавлением 1% пенициллин-стрептомицина (пен/стрептококк) и (продолжая использовать стерильные методы в биобезопасном шкафу) ресуспендируют выделенные моноциты в этой среде в концентрации 1 x 106 клеток/мл.
- Добавьте по 1 мл ресуспендированных клеток в каждую лунку 6-луночного планшета или в чашку диаметром 35 мм (окончательное количество клеток должно составлять 1 x 106 клеток/планшет) и поместите в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2. Подождите 0,5-1,0 ч, чтобы ячейки прилипли.
- С помощью водяной бани с температурой 37 °C тепло инактивированную (HI) фетальную бычью сыворотку (FBS). Добавьте 100 мкл (10% конечной концентрации) FBS на каждую пластину. Добавляйте в клетки факторы роста, чтобы способствовать дифференцировке макрофагов.
- Праймируйте макрофаги для М1-подобного фенотипа путем добавления 25 нг/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) в среду. Праймируйте макрофаги для М2-подобного фенотипа путем добавления 50 нг/мл колониестимулирующего фактора макрофагов (M-CSF) в среду.
заметка: Как GM-CSF, так и M-CSF обеспечивают дифференцировку моноцитов к общему фенотипу макрофагов (M0), одновременно подготавливая клетки к M1 или M2 соответственно.
