Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Выделение и культивирование ПМК методом внутрибрюшинного лаважа
- Выделение ПМК методом внутрибрюшинного лаважа
- Перед изоляцией клеток подготовьте материалы, перечисленные в таблице 1.
- Используйте мышей мужского пола в возрасте от 8 до 14 недель для изоляции PMC. Усыпьте мышь путем вдыхания CO2 и подтвердите смерть от потери рефлексов. Сбрызните мышь 70% этанолом и закрепите ее на поролоновом блоке с помощью булавок (тыльной стороной вниз). Снимите брюшную кожу мыши с помощью ножниц с тупым краем. Избегайте повреждения брюшной полости.
заметка: Обычно мы используем этот протокол для мышей с генетическим фоном штамма C57BL/6N.
- Введите 7 мл ледяной среды RPMI и 5 мл воздуха в брюшную полость с помощью шприца объемом 10 мл, оснащенного иглой 27 G. Осторожно вдавливайте иглу в брюшину и не прокалывайте никаких органов. Используйте пятно в области жировой ткани придатка яичка, чтобы снизить риск перфорации органа.
- После инъекции встряхните мышь в течение 1 минуты, чтобы удалить клетки брюшины в среду RPMI. Не трясите мышь слишком сильно, чтобы не повредить внутренние органы и не загрязнить кровью брюшную полость.
- Повторно используйте шприц объемом 10 мл, оснастив его новой канюлей 20 г. Сдвиньте внутренние органы в одну сторону, наклонив поролоновый блок и осторожно постучав им по скамье, чтобы облегчить аспирацию среды с другой стороны. Введите иглу 20 G, нанесите скос вверх и осторожно и медленно (~0,5 мл/с) отсасывайте жидкость из брюшной полости, чтобы избежать закупорки внутренними органами. Соберите как можно больше жидкости (обычно 5–6 мл).
- Извлеките иглу из шприца и перенесите собранную клеточную суспензию в сборную пробирку на льду. Выбросьте пробирку с образцом, если есть видимое загрязнение крови.
- Центрифугируйте пробирки с клеточной суспензией при давлении ~300 x g в течение 5 минут. Под стерильным капюшоном отсасывают надосадочную жидкость. Для каждой мыши смешайте образцы гранул в 4 мл холодной (4–10 °C) среды PMC и перенесите клеточную суспензию в колбудля культур размером 25 см2. Добавьте факторы роста IL-3 и SCF до конечных концентраций 10 нг/мл и 30 нг/мл соответственно. Поместите колбу с клетками в инкубатор (37 °C и 5%CO2) и инкубируйте в течение ~48 часов до следующей процедуры.
- Культура ЧВК
- День 2 (~48 ч после изоляции): Изменение среды
- Чтобы удалить надосадочную жидкость и неадгезивные клетки (эритроциты и мертвые клетки), отсасывайте среду из колбы, поместив наконечник пипетки Пастера на край колбы и держа колбу почти горизонтально. Добавьте 4 мл предварительно подогретого PMC Medium на каждую мышь. Добавьте факторы роста IL-3 (10 нг/мл) и SCF (30 нг/мл). Поместите колбу с клетками в инкубатор (37 °C и 5%CO2).
- День 9: Расщепление клеток
- Переложите клеточную суспензию из колбы для клеточных культур в пластиковую центрифужную пробирку объемом 50 мл. Промойте колбу три раза 10 мл предварительно подогретого (37 °C) фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS), собирая клеточную суспензию с отделенными клетками в той же пластиковой центрифужной пробирке объемом 50 мл. Посчитайте концентрацию клеток по гемоцитометру, и рассчитайте общее количество клеток.
- Центрифугируйте клеточную суспензию при ~300 x g в течение 5 минут и аспирируйте надосадочную жидкость. Соберите гранулу в предварительно нагретой среде PMC (37 °C) до получения концентрации клеток 1 x 106 клеток/мл. Перенесите клеточную суспензию в новую культуральную колбу размером 25 см2. Выбросьте старую колбу с прилипшими к дну фибробластами.
- Добавьте факторы роста IL-3 (10 нг/мл) и SCF (30 нг/мл) и поместите колбу с клетками в инкубатор (37 °C и 5%CO2).
- Дни 12–15: Измерения клеток
- Если планируются эксперименты со стимуляцией рецепторов FcɛRI, предварительно обработайте клетки в течение ночи 300 нг/мл анти-DNP IgE в стандартной питательной среде.
2. Измерение высвобождения бета-гексозаминидазы в PMC
- Перед проведением измерений подготовьте материалы, перечисленные в таблице 2.
Примечание: β-гексозаминидаза, высвобождаемая из ТК после их стимуляции, гидролизует-нитрофенил-ацетил-D-глюкозамин (pNAG) в-нитрофенол и N-ацетил-D-глюкозамин. Количество β-гексозаминидазы в образце пропорционально количеству-нитрофенола, которое будет образовано. В среде с высоким pH «Stop Solution»-нитрофенол существует в виде полностью депротонированного-нитрофенолата и может быть обнаружен по его поглощению света при длине волны 405 нм.
- Приготовьте раствор Tyrode, содержащий 130 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,4 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, 5,6 мМ глюкозу и BSA 0,1%. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью 3 М NaOH.
- Приготовьте раствор для лизиса, добавив 1% объем Triton X-100 в раствор Tyrode.
- Приготовьте стоп-раствор из 200 мМ глицина и отрегулируйте pH до 10,7 с помощью NaOH.
- Готовят раствор pNAG (4-нитрофенил2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-глукопиранозид) путем растворения pNAG в 0,4 М лимонной кислоте до конечной концентрации 4 мМ.
- Рассчитайте количество клеток, необходимых для проведения анализа (выполните анализ в двух экземплярах). Используйте 200 000 PMC на скважину. Используйте 2 лунки в качестве отрицательного контроля (раствор Тайроде без каких-либо секретагогов, таких как ДНФ или соединение 48/80) и 2 лунки в качестве положительного контроля (раствор Тайроде с 10 мкМ иономицином) для каждого генотипа.
- Перенесите клетки в пластиковую центрифужную пробирку объемом 15 мл, отрегулируйте объем до 15 мл с помощью раствора Tyrode и центрифугируйте при 200 x g в течение 4 мин. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки Пастера и повторно суспендируйте клетки в растворе Tyrode до концентрации 2 x 106 клеток/мл.
- Переведите 100 мкл суспензии ячеек на лунку в 96-луночный планшет с V-образным дном. Добавьте в каждую лунку по 25 мкл раствора для стимуляции или контроля (в соответствии со схемой пипетирования, показанной на рисунке 1А). Инкубируйте клетки в течение 45 мин при 37 °C и 5%CO2.
- Остановите реакцию, поместив 96-луночный планшет на лед на 5 минут. Затем центрифугируйте планшет при 4 °C в течение 4 мин при 120 x g. Перенесите 120 мкл надосадочной жидкости с помощью многоканальной пипетки на 96-луночный планшет с плоским дном и положите его на лед. Тщательно избегайте прикосновения к клеточным гранулам, но полностью отсасывайте надосадочную жидкость.
- Добавьте 125 μл буфера для лизиса в клеточные гранулы. Инкубируйте клеточные гранулы в течение 5 минут при комнатной температуре и повторно суспендируйте их после инкубации путем повторного пипетирования (примерно 5 раз).
- Пипетка 25 мкл раствора pNAG (4 мМ) в необходимые лунки нового 96-луночного планшета с плоским дном. Добавьте в приготовленный раствор pNAG по 25 мкл от каждой надосадочной жидкости, а также по 25 мкл каждого клеточного лизата.
- Инкубируйте реакционные партии в течение 1 ч при 37 °C. После инкубации пипеткой в каждую лунку впрыскивается 150 мкл стоп-раствора, чтобы остановить реакцию.
- Проанализируйте пластину с помощью считывателя микропланшетов с использованием двухволновой настройки на 405 нм с опорным значением 630 нм для автоматического вычитания фона. В программе получения данных поставьте галочку в поле «Справка» и в меню элемента программы «Поглощение» выберите из выпадающего списка «630 нм». Если оптическая плотность образцов слишком высока, перед повторным измерением подготовьте соответствующее разведение зонда.
Таблица 1: Материалы для шага 1.
| 1 | лёд |
| 2 | Шприцы 10 мл |
| 3 | Иглы 27 г |
| 4 | Иглы 20 г |
| 5 | Блок из пенополистирола и штифты |
| 6 | Пробирки для сбора (пластиковые центрифужные пробирки объемом 50 мл) |
| 7 | 70% этанол |
| 8 | RPMI Medium (предварительно охлажденный и выдержанный на льду) |
| 9 | Среда PMC: RPMI Medium + 20% FCS (сыворотка для телят) + 1% раствор пенициллина стрептомицина (Pen-Strep) |
| 10 | Фосфатный буферный раствор Дульбекко - DPBS (без Ca2+ и Mg2+) |
| 11 | Колбы для культур (25 см) |
| 12 | Исходные растворы факторов роста (IL-3: 1 μг/μл; SCF: 2,5 мкг/мл) |
| 13 | Серологические пипетки (10 мл) |
| 14 | Наконечники для пипеток стерильные (20–200 μл) |
| 15 | Гемоцитометр |
| 16 | Настольная центрифуга |
| 17 | Ножницы и щипцы |
| 18 | Камера CO2 для мышей |
| 19 | Открытая стерильная капюшон |
| 20 | Закрытый стерильный капюшон |
| 21 | Клеточный инкубатор (37 °C и 5%CO2) |
| 22 | Трансферные пипетки (20–200 μл) |
Таблица 2: Материалы для шага 2.
| 1 | PMC (12–15 дней) 1 x 106 клеток/мл |
| 2 | Стоковый раствор анти-ДНФ-антител (IgE) |
| 3 | Решение для склада DNP-HSA |
| 4 | Компаунд 48/80 стоковый раствор |
| 5 | Иономицин |
| 6 | 96-луночный планшет, V-образное дно |
| 7 | 96-луночные планшеты, плоское дно |
| 8 | Пластиковые центрифужные пробирки (15 мл) |
| 9 | Серологические пипетки |
| 10 | Клеточный инкубатор (37 °C и 5%CO2) |
| 11 | Настольная центрифуга |
| 12 | Считыватель микротитровальных планшетов для измерения оптической плотности |
| 13 | Многоканальный пипетка (20–200 μл) |
| 14 | Гемоцитометр |
