Выделение и культивирование мышиных клеток Купфера

Аннотация

Источник: Bourgognon, M., et al. Выделение клеток Купфера для тестирования токсичности наночастиц. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео мы демонстрируем выделение клеток Купфера или макрофагов печени мыши из печени мыши. Печень перфузируется раствором для сбраживания с последующим разделением по градиенту плотности. Выделенные адгезивные клетки Купфера могут быть использованы для дальнейшего анализа.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Перфузия и сбор клеток (Рисунок 1)

1. Приготовьте свежие все реактивы, описанные в таблице материалов.
2. Подогрейте раствор EGTA (тетрауксусная кислота этиленгликоля)/HBSS (сбалансированный раствор соли Хэнка) (50 мл на мышь) и раствор коллагеназы (100 мл на мышь) в течение 30 минут при 40 °C.
3. Сначала промойте гибкую трубку насоса 70% этанолом. Налейте 40 мл раствора EGTA/HBSS в центрифужную трубку, погруженную в водяную баню, и промойте гибкую трубку насоса предварительно подогретым раствором EGTA/HBSS.
4. Выполните терминальную анестезию с использованием барбитуратов, чтобы надежно вызвать потерю сознания до угнетения дыхания и смерти. Введите фенобарбитал в дозе 1 мг/кг, в/ч самке или самцу мыши с CD1 (35-45 г). Подтвердите анестезию пощипыванием пальцев ног.
5. Сбрейте волоски на животе и простерилизуйте брюшную поверхность с помощью 70% раствора этанола.
6. Разрежьте брюшную полость и обнажите воротную вену и нижнюю полую вену, переместив кишечник латерально влево от брюшной полости.
7. Запустите помпу со скоростью 1-3 мл/мин с помощью раствора EGTA/HBSS и канюлируйте воротную вену с помощью иглы-бабочки весом 23 г (разрежьте крылья). Зажмите участок воротной вены, канюлированный иглой 23 G, а затем переверните зубчатые щипцы на поверхности открытого брюшка мыши. Печень должна быстро побледнеть в течение первых 30 секунд после перфузии раствором EGTA/HBSS.
8. Быстро разрежьте нижнюю часть нижней полой вены, чтобы избежать избыточного давления в печени, а затем постепенно увеличивайте скорость потока до 7 мл/мин в течение первой минуты перфузии. Животное погибает из-за кровотечения, вторичного по отношению к венозной венепункции.
9. Когда в пробирке центрифуги останется менее 5 мл раствора EGTA/HBSS, заполните его раствором коллагеназы (40-50 мл). Постепенно увеличивайте скорость потока до 10 мл/мин, в течение 30 сек.
10. Заставьте печень набухнуть, надавливая на нижнюю полую вену с помощью пинцета с интервалом 5-10 секунд. Это можно делать периодически (5-10 раз во время пищеварения). Этот шаг улучшит диссоциацию клеток печени и сократит время перфузии коллагеназой.
11. Когда в пробирке центрифуги останется менее 10 мл раствора коллагеназы, налейте в пробирку центрифуги 40-50 мл предварительно подогретого раствора коллагеназы.
12. После 10-15 минут перфузии и перфузирования около 70-80 мл раствора коллагеназы надавите на поверхность печени с помощью щипцов. Отпечаток давления указывает на то, что клетки печени диссоциированы.
13. Извлеките печень из брюшной полости целиком и поместите ее в центрифужную пробирку, содержащую 20-30 мл изоляционной среды для клеток Купфера. Держите клетки печени на льду или при температуре 4 °C в течение не более 3 часов, чтобы не повлиять на жизнеспособность клеток печени.
14. При необходимости повторите процедуру перфузии на нескольких животных, держа при этом перфузионированную печень на льду. Соберите от одной до трех печени для очистки и приступайте к этапу 3.

2. Подготовка градиента плотности для центрифугирования (рисунок 2)

1. Выполните следующие шаги (разделы 2, 3 и 5) в стерильных условиях и держите клетки на льду или при температуре 4 °C. Приготовьте SIP (раствор изотонически покрытых частиц диоксида кремния), смешав 15,3 мл раствора частиц диоксида кремния, покрытых оболочкой, с 1,7 мл 10 x PBS.
2. Чтобы приготовить 20 мл 25% раствора SIP, смешайте 5 мл SIP с 15 мл PBS. Чтобы приготовить 20 мл 50% раствора SIP, смешайте 10 мл SIP с 10 мл PBS.
3. Наполните одну пробирку центрифуги 20 мл 50% раствора SIP. Наклоните центрифужную пробирку под углом, близким к 90°, и медленно добавьте 25% раствор SIP (20 мл) на боковую стенку пробирки с помощью серологической пипетки объемом 25 мл, не касаясь поверхности 50% слоя SIP. При добавлении 25% раствора SIP постепенно уменьшайте угол наклона трубки. Сохраняйте градиент плотности на льду до использования.

3. Очистка клеток Купфера (Рисунок 3)

1. Положите одну перфузированную печень в чашку Петри с 15 мл среды для выделения клеток Купфера. Разорвите капсулу Глиссона (мембрану печени) с помощью ножниц и высвободите все клетки печени в изоляционную среду для клеток Купфера. Отфильтруйте раствор через сетчатый фильтр 100 мкм и соберите его в центрифужную пробирку. Повторите процедуру перфузии на дополнительной перфузии печени и объедините клетки в той же центрифужной пробирке (15 мл от одной мыши, и до 45 мл от трех мышей).
2. Центрифугируйте клеточную суспензию при 50 х г в течение 2 мин при 4 °С. Паренхиматозные клетки (гепатоциты) будут находиться в грануле, а непаренхиматозные клетки (включая клетки Купфера) будут в надосадочной жидкости.
3. Соберите надосадочную жидкость в чистую центрифужную пробирку и центрифугируйте при давлении 50 x g в течение 2 мин каждая. Повторите этот шаг еще три раза.
4. Центрифугируйте при давлении 1 350 x g в течение 15 мин для гранулирования непаренхиматозных клеток. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 10 мл среды для изоляции клеток Купфера.
5. Добавьте раствор непаренхиматозных клеток на прерывистый изотонический градиент 25/50%, как описано в 2.3. Центрифуга при давлении 850 x g в течение 15 мин без ускорения и перерыва.
6. Локализуйте обогащенную фракцию клеток Купфера, помутневшую, в пределах 25% фракции SIP вблизи интерфейса 25/50% SIP (рис. 3). С помощью серологической пипетки объемом 10 мл аспирируйте около 12 мл обогащенной фракции клеток Купфера. Перенесите клетки в центрифужную пробирку, содержащую 35-40 мл изоляционной среды для клеток Купфера. Осторожно перемешайте и центрифугируйте при 1 350 x g в течение 15 минут при 4 °C до гранулированных ячеек.
7. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 5-10 мл предварительно подогретой среды для культивирования клеток Купфера. Подсчитайте клетки (гемоцитометр) и измерьте жизнеспособность с помощью окрашивания трипановым синим.
8. Очищенные непаренхиматозные клетки помещают в 24-луночные планшеты с плотностью 5 x 10⁵ клеток/лунку. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%_CO2 (рис. 3). Через 30 минут аккуратно удалите среду, промойте предварительно подогретым раствором сбалансированной соли Хэнка (HBSS) один раз, затем замените его 500 μл свежей и предварительно подогретой среды для культивирования клеток Купфера (на лунку).

Результаты

Рисунок 1: Перфузия печени. После анестезии мыши пищеварительный тракт перемещается в сторону слева от брюшной полости, чтобы сделать воротную вену (ПВ) доступной. ПВ канюлируют с помощью медленного потока (1-3 мл/мин) раствора EGTA/HBSS, и нижняя полая вена (НПВ) немедленно разрывается, чтобы избежать избыточного давления в печени. В течение первой минуты перфузии скорость потока постепенно увеличив...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Эутатал (пентобарбитал натрия)	Мериал
Мыши CD1	Чарльз Ривер	- T	Вес мыши должен варьироваться от 35 до 45 г. Мы рекомендуем использовать самцов мышей CD1, так как их вес быстро увеличивается (например, вес самца мыши CD1 в возрасте 7 недель превышает 35 г). Также рекомендуется заранее связаться с поставщиком животных, чтобы договориться о доставке более старых животных. В качестве альтернативы животные могут находиться в помещении для достижения желаемого веса.
HBSS (без Ca2+ и Mg2+, с бикарбонатом)	Технологии Life	14175-053	HBSS должен быть бесплатным Ca2+.
Этиленгликоль тетрауксусная кислота (EGTA) тетранатриевая соль	Сигма-Олдрич	Е8145	ЭДТА также может быть использована, но EGTA имеет преимущество в избирательном хелатировании Ca2+.
ГЕПЕС (1М)	Технологии Life	15630-056	100 мл
Коллагеназа IV типа	Уортингтон	КСЛ-4	Рекомендуется протестировать разные партии коллагеназы или, по крайней мере, указать поставщику, что продукт должен быть пригодным для выделения клеток печени
Низкий уровень глюкозы DMEM	Сигма-Олдрич	Д5523	500 мл
RPMI (с пируватом натрия и глутамаксом®)	Технологии Life	12633-012	500 мл
Пенициллин/Стептомицин	Технологии Life	15140-122	100 мл
Фетальная бычья сыворотка	Первое звено	Тел.: 60-00-850	500 мл
Трипановый синий раствор	Сигма-Олдрич	Т8154	100 мл
Покрытый раствор частиц диоксида кремния (Percoll®)	GE Healtcare	17-0891-02 (Английский	Percoll® очень стабилен и может храниться в течение нескольких лет
1x Фосфатно-солевой буфер	Технологии Life	10010-023	500 мл
10x Фосфатно-солевой буфер	Технологии Life	70011-036	500 мл
Набор для сбора крови бабочек (трубка длиной 23 г / 305 мм)	БД	367288
Шприцевые фильтры (0,22 μм синий ободок)	Минизарт	16534-К
Центрифужные пробирки (50 мл Blue Cap)	BD Biosciences, Falcon	35 2070
Чашка Петри (90 x 15 мм)	Thermo Fisher Scientific	БСН 101ВР20
Сетчатый фильтр 100 μм	БД	No 352360 (Английский
Перистальтический насос	Уотсон Марлоу	SciQ 300	Промывайте трубки до и после каждого использования стерильным PBS и 70% этанолом.
24-луночные планшеты	Корнинг	No 3526
центрифуга	Эппендорф	5810Р
Щипцы Serrefine	Хаммахер ГмбХ	Арт. НИУ ВШЭ 004-35 / Кат. 221-0051	Зубчатые щипцы позволяют зажимать сосуд, канюлированный иглой 23G, без необходимости удерживать щипцы во время процедуры перфузии. URL-адрес: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
Скребок для ячеек	BD Biosciences, Falcon	353086	Отрежьте ножницами конечности лезвий, чтобы соскоблить ячейки в 24-луночных планшетах.
Раствор EGTA (этиленгликольтетрауксусной кислоты)/HBSS (сбалансированный раствор соли Хэнка)			HBSS, содержащий 0,5 мМ EGTA и 25 mM HEPES. Отрегулируйте pH до 7,4. Приготовьте по 50 мл на каждую печень для перфузии.
Раствор коллагеназы			DMEM с низким содержанием глюкозы, содержащая коллагеназу IV типа в дозе 100 ЕД/мл, 15 мМ HEPES и 1% пеникллин/стрептамицин (v/v). Отрегулируйте pH до 7,4. Приготовьте по 100 мл на каждую печень для перфузии. После добавления коллагеназы рекомендуется прогреть раствор в течение 30 минут перед использованием. Это позволяет поддерживать оптимальную активность коллагеназы.
Среда для изоляции клеток Купфера			RPMI содержит, 1% заменимых аминокислот (v/v), 1% глутамакса® (v/v) и 1% пениклена/стрептомицина (v/v). Приготовьте не менее 100 мл на 1-3 печени.
Среда для культивирования клеток Kupffer			RPMI содержит 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% заменимых аминокислот (v/v), 1% глутамакса® (v/v) и 1% пениклена/стрептамицина (v/v). Приготовьте не менее 100 мл на 1-3 печени.
СИП (раствор изотонических частиц диоксида кремния)			Смешайте 1,7 мл 10x фосфатно-солевого буфера с 15,3 мл Percoll®, чтобы получить 17 мл SIP.
25% SIP раствор			Смешайте 5 мл SIP с 15 мл 1x Phosphate Buffered Salt
50% SIP решение			Смешайте 10 мл SIP с 10 мл 1x Фосфатного буферного раствора
Буфер для лизиса			Фильтрующий материал DMEM с 0,9% Triton X-100
Решение PBS/BSA			Приготовьте свежий фосфатно-солевой буфер pH 7,4 с 1% бычьим сывороточным альбумином.

) )