Методическая статья

Дифференцировка индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в макрофаги

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Lopez-Yrigoyen, M., et al. Производство и характеристика макрофагов человека из плюрипотентных стволовых клеток. J. Vis. Exp. (2020).

Это видео описывает метод in vitro для получения макрофагов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSCs). Генерация макрофагов из ИПСК происходит в три этапа: (i) агрегация ИПСК в суспензии с образованием трехмерных эмбриоидных телец (БЭ), которые дифференцируются в мезодермальные клетки, (ii) образование клеток-предшественников макрофагов из дифференцированных БЭ и (iii) дифференцировка клеток-предшественников макрофагов в зрелые, функциональные макрофаги.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Дифференцировка iPSC человека до макрофагов

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое резюме протокола дифференцировки макрофагов показано на рисунке 1.

  1. Приготовление факторов роста клеточной дифференцировки и других реагентов
    1. Приготовление питательных сред без сыворотки эмбриональных стволовых клеток человека (hESC-SFM; см. Таблицу материалов) путем добавления модифицированного Дульбекко Eagle medium-F12 (DMEM/F12) с добавкой hESC, 1,8% б/в бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола.
    2. Приготовьте 0,1% массовый раствор свиного желатина, растворив желатин в стерильной воде. Желатиновый раствор может храниться при температуре 4 °C до 2 лет.
    3. Приготовьте стоковый раствор костного морфогенетического белка (BMP4) человека (25 мкг/мл) путем растворения BMP4 в 4 мМ растворе хлористого водорода (HCl)-0,2% BSA PBS. Распределите исходный раствор в виде аликвот по 50 мкл в криопробирках. Исходные растворы могут храниться при температуре -20 °C до 1 года. После размораживания стоковый BMP4 можно хранить при температуре 4 °C в течение 5 дней.
    4. Готовьте стоковый раствор фактора роста эндотелия сосудов человека (VEGF) (100 мкг/мл) путем растворения VEGF в 0,2% растворе BSA PBS. Распределите исходный раствор в виде 10 мкл аликвот в криопробирках. Исходные растворы могут храниться при температуре -20 °C до 1 года. После размораживания исходный VEGF можно хранить при температуре 4 °C в течение 7 дней.
    5. Приготовьте стоковый раствор фактора стволовых клеток человека (SCF) (100 мкг/мл) путем растворения SCF в 0,2% растворе BSA PBS. Распределите исходный раствор в виде аликвот по 5 мкл в криопробирках. Исходные растворы могут храниться при температуре -20 °C до 1 года. После размораживания исходный SCF можно хранить при температуре 4 °C в течение 10 дней.
    6. Приготовьте стоковый раствор интерлейкина-3 человека (IL3) (10 мкг/мл) путем растворения IL3 в 0,2% растворе BSA PBS. Распределите исходный раствор в виде аликвот по 500 мкл в криопробирках. Стоковые растворы могут храниться при температуре -20 °C до 2 лет. После размораживания исходный IL3 можно хранить при температуре 4 °C в течение 15 дней.
    7. Приготовьте стоковый раствор макрофагального колониестимулирующего фактора (CSF1) (10 мкг/мл) путем растворения CSF1 в 0,2% растворе BSA PBS. Распределите исходный раствор в виде 1 мл аликвот в криопробирках. Стоковые растворы могут храниться при температуре -20 °C до 2 лет. После размораживания исходный CSF1 можно хранить при температуре 4 °C в течение 15 дней.
  2. Стадия 1: Генерация эмбриоидных тел (день 0–день 3)
    1. В день 0 добавьте 2,25 мл среды стадии 1 (hESC-SFM с добавлением 50 нг/мл BMP4, 50 нг/мл VEGF и 20 нг/мл SCF) в две лунки 6-луночных планшетов со сверхнизким присоединением.
    2. Замените поддерживающую среду из одной 80% конфлюентной лунки iPSCs в 6-луночном планшете на 1,5 мл среды Stage 1.
    3. Разрежьте колонии с помощью инструмента для пропускания клеток и перенесите отрезанные колонии с помощью пипетки в две лунки сверхнизкой насадки 6-луночного планшета (см. Таблицу материалов).
    4. На 2-й день доведите цитокины до конечной концентрации BMP4 (50 нг/мл), VEGF (50 нг/мл) и SCF (20 нг/мл), используя 0,5 мл среды hESC-SFM.
      заметка: Колонии IPSC станут EB (рисунок 2A).
  3. Стадия 2: Возникновение гемопоэтических клеток в суспензии
    1. На 4-й день покройте 4 лунки 6-луночного тканевого планшета 0,1% желатина и инкубируйте не менее 10 минут.
    2. Удалите желатин и добавьте 2,5 мл среды Stage 2 (X-VIVO15 с добавлением 100 нг/мл CSF1, 25 нг/мл IL-3, 2 мМ глутамакса, 1% пенициллин-стрептомицина и 0,055 мМ 2-меркаптоэтанола).
    3. Соберите образовавшиеся БЭ в центрифужную пробирку объемом 50 мл и дайте им осесть на дне пробирки под действием силы тяжести. Осторожно отсасывайте среду.
    4. Ресуспендируйте БЭ в 2 мл среды Stage 2.
    5. Переложите 10–15 ЭБ (не более 15) в лунку, покрытую желатиновым покрытием, содержащую 2,5 мл среды 2-й стадии.
    6. Инкубируйте EB при 37 °C и 5%CO2 в воздухе.
    7. Меняйте носители на покрытых БЭ каждые 3–4 дня в течение 2–3 недель.
    8. Через 2–3 недели БЭ начинают выделять неадгезивные гемопоэтические клетки в суспензию.
      заметка: Этот период высвобождения суспензионных клеток может варьироваться и зависит от клеточной линии. Клетки в этой суспензии могут быть собраны и превращены в макрофаги (см. стадию 3) (рис. 2A).
  4. Стадия 3: Созревание терминальных макрофагов
    1. Соберите суспензию гемопоэтических клеток и восполните среду (среда 2 стадии) на пластине EB.
    2. Центрифугируйте суспензию ячеек при 200 х г в течение 3 мин.
    3. Ресуспензию суспензионных клеток в средах стадии 3 (X-VIVO15 с добавлением 100 нг/мл CSF1, 2 мМ глутамакса и 1% пенициллин-стрептомицина).
    4. Планшет собирал и вращал клетки на необработанных пластиковых 10-сантиметровых бактериологических планшетах (10 мл) или непокрытых 6-луночных тканевых культуральных планшетах (3 мл) с плотностью 0,2 x 106 клеток/мл.
    5. Держите клетки в средах стадии 3 в течение 9–11 дней, меняя среду каждые 5 дней.
      заметка: Шаги 1.4.1–1.4.5 из стадии 3 можно повторять каждые 3–4 дня, а суспензионные клетки можно собирать из исходного планшета EB в течение 3 месяцев.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Графическое резюме дифференцировки iPSC до зрелых функциональных макрофагов. Диаграмма нарисована с помощью Biorender.

figure-results-2
Рисунок 2: Дифференцировка иПСК в сторону макрофагов и числа и морфологии иПСК-СД. (A) Изображения яркого...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CellMask Deep Red Plasma Membrane StainТермофишерС10046Носители для криоконсервации
Криостар CS10сигмаС2874
Субстрат CTS CELLstartИнвитрогенA1014201Субстрат стволовых клеток
Желатин из свиной кожисигмаГ9136
Рекомбинантный человеческий белок BMP4НИОКР314-ВР-010
Рекомбинантный человеческий IL3ПрепротехТел.: 0200-03-10
Рекомбинантный человеческий MCSF (без носителей) 100 мкгБиолегенда574806
Рекомбинантный человеческий белок VEGFНИОКР293-ВЕ-010
SCF (лиганд C-kit) Рекомбинантный белок человекаТермофишерPHC2111
StemPro hESC SFMТермофишерA1000701
StemPro EZPassage Одноразовый инструмент для пассажа стволовых клетокТермофишер23181010
Пластины со сверхнизким уровнем прикрепления: многолуночный планшет для клеточных культур, 6 лунок, поверхность для отпугивания клеток клеточной звездыГрейнерNo 657970 (Английский
2-Меркаптоэтанол (50 мМ) Инвитроген 31350010
DPBS, кальций, магний (500мл)Термофишер 14040091
Добавка GlutaMAX Термофишер 35050061
)

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CSF1

Похожие статьи