Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Калифорнийском университете в Сан-Франциско и проводились в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Соберем поясничный DRG у экспериментальных мышей
- Перед началом эксперимента приготовьте рабочий раствор среды с градиентом плотности (например, Percoll), смешав 9 объемов среды с 1 объемом 10x HBSS, не содержащих Ca++/Mg++. Держите его на льду.
- Обезболите мышь 2,5% Авертином. Подтвердите, что животное полностью обезболено отсутствием реакции на щипок задней лапы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались как самцы, так и самки мышей в возрасте 6-8 недель.
- Перфузируйте мышь транскардиально 10 мл предварительно охлажденного 1x PBS.
- Поместите мышь в лежачее положение четырьмя лапами, закрепленными лентой, внутри вытяжного шкафа для химикатов. Поднимите кожу ниже грудной клетки с помощью щипцов, и сделайте небольшой разрез хирургическими ножницами, чтобы обнажить печень и диафрагму.
- Продолжайте использовать ножницы, чтобы разрезать диафрагму и грудную клетку, и откройте плевральную полость, чтобы обнажить бьющееся сердце.
- Быстро отрежьте правый придаток предсердия ножницами по радужной оболочке. Как только кровотечение будет отмечено, введите иглу 30 G в задний конец левого желудочка и медленно введите 10 мл предварительно охлажденного 1x PBS для перфузии животного.
- Выполните дорсальную ламинэктомию мыши, расположенной в положении лежа.
заметка: Если планируется культивирование клеток, перед разрезом распылите на мышь 70% этанол и используйте предварительно стерилизованные хирургические инструменты для вскрытия.
- Используйте скальпель размера 11, чтобы сделать один продольный боковой глубокий разрез, начиная от грудного отдела вниз до крестцового отдела. Снимите кожу ножницами, чтобы обнажить дорсальный мышечный слой.
- Используйте метод Фридмана-Пирсона Ронгера для отшелушивания соединительных тканей и мышц до тех пор, пока не обнажатся отростки пояснично-крестцового отдела позвоночника и двусторонние поперечные отростки.
- Используйте пружинные ножницы Нойеса, чтобы осторожно открыть спинной столб позвоночника, затем переключитесь на пружину Фридмана-Пирсона, чтобы удалить позвоночные кости, чтобы обнажить спинной мозг с неповрежденными спинномозговыми нервами.
- Тщательно рассеките ипсилатеральный и контралатеральный поясничный DRG (L4/L5 DRG в нашем исследовании) и поместите его в 1 мл ледяного Ca++/Mg++-free 1x HBSS в тканевый гомогенизатор Dounce. Теперь ткани готовы к шагу 2.
заметка: По возможности обрежьте спинномозговой нерв, прикрепленный к DRG.
2. Выделите отдельные клетки из поясничного отдела DRG мыши
- Гомогенизировать ткань DRG рассыпчатым пестиком в гомогенизаторе Dounce 20-25 раз.
- Поместите стерильный нейлоновый клеточный фильтр 70 мкм в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. Смочите сетчатый фильтр 800 мкл ледяного 1x HBSS, и проточный поток собирается в конической трубке.
- Соберите гомогенизированную тканевую суспензию из гомогенизатора с помощью пипетки и пропустите через влажный нейлоновый клеточный фильтр 70 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл.
- Дважды промойте гомогенизатор 800 мкл ледяного 1x HBSS, а затем сцедите его в ту же коническую пробирку объемом 50 мл с клеточным фильтром для увеличения выхода.
- Добавьте 1,5 мл уравновешенной ледяной изотонической среды градиента плотности (приготовленной на шаге 1.1) в стерильную полистирольную пробирку FACS объемом 5 мл.
- Перенесите гомогенат клеток из конической пробирки объемом 50 мл (на шаге 2.4) в пробирку FACS и хорошо перемешайте со средой с градиентом плотности путем пипетирования вверх и вниз. Добавьте еще 500 мкл 1x HBSS, чтобы запечатать верхнюю часть.
- Гранулируйте клетки центрифугированием при 800 x g в течение 20 минут при 4 °C.
- Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, содержащую миелин, в среде, не нарушая клеточную гранулу на дне пробирки FACS.
- Ресуспендируйте клетки в буфере PBS или FACS, содержащем 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) для анализа FACS.
заметка: Ожидается, что от L4 /L5 DRG одной мыши потребуется от 50 000 до 100 000 клеток.
- Ресуспендируют механически выделенные клетки DRG (L4/L5) в 100 мкл PBS, содержащей 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, а затем инкубируют с антителом CX3CR1-APC α мыши (1:2000) в темноте при 4 °C в течение 1 ч.
- Промойте ячейки 5 мл PBS один раз; центрифугируйте ячейки 360 x g в течение 8 минут при 4 °C.
- Аспирируйте надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в 300 мкл PBS для анализа FCAS. Если планируется сортировка ячеек, вместо этого повторно присутнируйте ячейки в буфере FACS.