Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Этапы хирургического иссечения и подготовки тканей:
- Хирургическое удаление тонкой кишки (СИ)
- Усыпляйте мышей с помощью асфиксии CO2 или любого эквивалентного метода, одобренного институциональным комитетом по этике животных.
- Перенесите мышь в специальную область для хирургического иссечения. Положите заднюю часть вниз и продезинфицируйте живот 70% этанолом. Выполните лапаротомию, разрезав кожу брюшной полости и брюшину по средней линии от лобка до грудной клетки, тем самым открыв брюшинную полость.
заметка: Выполняйте первый разрез на относительно небольшом участке кожи, чтобы избежать проникновения в брюшную полость и повреждения тканей кишечника. Продолжайте иссечение до достижения нужной анатомической границы.
- Определите слепую кишку, которая является идеальным ориентиром для обнаружения терминального отдела подвздошной кишки, который представляет собой дистальный сегмент тонкой кишки.
заметка: Слепая кишка обычно расположена в нижней левой части брюшка мыши.
- Точно определите илеоцекальное соединение и сделайте надрез на этом уровне как можно более дистально, чтобы отделить тонкую кишку от слепой кишки. На следующих этапах избегайте чрезмерного физического контакта со стенками кишечника, потому что хрупкие ПП легко разрушаются при прикосновении.
- Аккуратно удалите всю тонкую кишку до пилорического сфинктера, разрезав брыжейку с помощью ножниц. Определите место соединения между привратником и двенадцатиперстной кишкой, и срежьте двенадцатиперстную кишку на этом уровне, что приведет к полному отслоению тонкой кишки от брюшной полости.
ПРИМЕЧАНИЕ: (i) Избегайте гиперэкстензии, так как это может привести к разрыву стенки кишечника. (ii) Если желательно выделение лимфоцитов ЛП в дополнение к лимфоцитам РР, необходимо полное удаление брыжеечного жира. Тем не менее, только при выделении ПП, оставшийся брыжеечный жир может обеспечить некоторые преимущества на последующих этапах изоляции; Поэтому его следует сохранить.
- Поместите отделенную тонкую кишку в 6-луночную пластину, наполненную холодной RPMI + 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и осторожно взбалтывайте ткани вручную, пока все сегменты кишечника не будут погружены в холодную среду. Поддерживайте ткани на льду на протяжении следующих шагов.
- После рассечения нужного количества тонкого кишечника мыши приступают к иссечению РР из собранного тонкого кишечника.
- Хирургическое иссечение ПП и приготовление суспензии одиночных клеток:
- Аккуратно переложите тонкую кишку на бумажное полотенце, захватив брыжеечный жир с помощью щипцов и положив брыжеечную сторону на бумажное полотенце. Смочите весь кишечный сегмент холодным RPMI + 10% FBS, чтобы избежать обезвоживания и липкости тканей.
заметка: Оставшийся брыжеечный жир может быть полезен на этом этапе, потому что сегменты жировой ткани на брыжеечной стороне SI будут прилипать к бумажному полотенцу, сохраняя антибрыжеечную сторону вверх.
- Определите ПП, которые проявляются в виде белых многодольных агрегатов в форме, «похожей на цветную капусту» на антибрыжеечной стороне стенки кишечника.
заметка: Не рекомендуется вымывать содержание люминала до тех пор, пока все ПП не будут удалены. Опорожнение содержимого просвета может привести к коллапсу ПП и предотвратить цветовой контраст между ПП и стенкой кишечника, что очень полезно для визуальной идентификации ПП.
- После выявления ПП на антиментерийной стороне поместите хирургические ножницы с изогнутым концом на ПП (изгиб должен быть обращен вверх), удерживая ПП от его дистальной и проксимальной границы.
необязательный: Осторожно надавите на полипропилен по направлению к лезвиям ножниц кончиком пальца. Этот маневр приведет к лучшему исключению окружающих тканей, не содержащих ПП. Аккуратно удалите ПП, исключив окружающую кишечную ткань.
ПРИМЕЧАНИЕ: (i) Этот шаг имеет решающее значение для получения максимального выхода РР-клеток при минимизации контаминации клеток из соседних кишечных компартментов, таких как ЛП и кишечный эпителий, которые также богаты Т-клетками. (ii) Из одного СИ, вырезанного из мыши C57BL/6, может быть собрано 5-10 ПП (среднего размера, многодольные). Стремясь к еще меньшим PP (не многодольным), с помощью этого протокола можно собрать до 12-13 PP на мышь (C57BL/6).
- Перенесите вырезанные ПП в 12-луночный планшет для культуры тканей, заполненный ледяным RPMI + 10% FBS и удерживаемый на льду с помощью щипцов или изогнутых хирургических ножниц.
ПРИМЕЧАНИЕ: (i) Сразу после удаления ПП слизь и содержимое кишечника на поверхности ПП можно очистить, аккуратно протерев ткань бумажным полотенцем. Этот шаг поможет улучшить жизнеспособность РР-лимфоцитов. (ii) Вместо переноса ПП на планшет в зависимости от общего количества проб также можно рассмотреть возможность переноса в отдельные пробирки.
- Дополнительно: После завершения эксцизии ПП и последующего помещения в луночный планшет количество и размер ПП, собранных из различных экспериментальных/мышиных групп, можно задокументировать, сфотографировав планшет для культуры тканей, содержащий ПП.
- Приготовьте набор из конических пробирок объемом 50 мл, наполненных 25 мл RPMI + 10% FBS (предварительно нагретых до 37 °C). С помощью ножниц отрежьте край наконечника объемом 1 000 мл с расстояния, которое позволит сделать аспирацию ПП пипеткой объемом 1 мл. Отсадите ПП с помощью пипетки объемом 1 мл и перенесите их из 12-луночного планшета для культуры тканей в подготовленные конические пробирки объемом 50 мл.
заметка: Используйте новый наконечник для каждого образца мыши, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами.
- Закройте крышку и поместите пробирки вертикально в орбитальный шейкер при температуре 37 °C с непрерывным перемешиванием при 125–150 об/мин в течение 10 минут. Тем временем приготовьте новый набор пробирок объемом 50 мл и поместите в верхнюю часть каждой пробирки клеточный фильтр 40 мкм, с помощью которого будет приготовлена одноклеточная суспензия><.
ПРИМЕЧАНИЕ: (i) На этапе перемешивания удаляется оставшееся содержимое кишечника, слизь и клеточный мусор, которые снижают жизнеспособность клеток и восстановление лимфоцитов РР, если их не удалить. (ii) Не применяйте какие-либо пищеварительные ферменты на ткани PP, поскольку процесс пищеварения вызывает резкую потерю экспрессии CXCR5 с поверхности клеток.
- После перемешивания переложите ПП в сетчатый фильтр 40 мкм, расположенный поверх только что подготовленных конических пробирок объемом 50 мл. Используя закругленную сторону поршня шприца объемом 10 мл, осторожно разрушьте ПП через сетчатое фильтр, чтобы получить одноклеточную суспензию. Промойте ситечко 15–20 мл холодного RPMI + 10 % FBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: (i) Перед фильтрацией встряхните трубки, содержащие полипропилен, горизонтально. Это короткое встряхивание облегчит перенос ПП в клеточные фильтры. (ii) Рекомендуется использовать клеточный фильтр размером 70 мкм для выделения нелимфоидных иммунных клеток (например, моноцитов, макрофагов, ДК).
- Центрифугирование одноклеточных суспензий при 350–400 x g в течение 10 мин при 4 °C.
- Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в концентрации 10 x 106 клеток/мл. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.