Выделение мононуклеарных клеток периферической крови из оболочки человека

Аннотация

Источник: Mily, A., et al. Поляризация M1 и M2 человеческих моноцитарных клеток и анализ с помощью проточной цитометрии при инфекции Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы демонстрируем выделение мононуклеарных клеток периферической крови, PBMC, содержащих моноциты и лимфоциты, из охристой оболочки человека с помощью центрифугирования с градиентом плотности. Выделенные PBMC могут быть использованы для дальнейшего анализа.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Подготовка среды

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация обо всех реагентах и расходных материалах представлена в таблице материалов.

1. Полная среда RPMI: Дополните RPMI 1640 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES и 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS). Избегайте антибиотиков в клеточной культуральной среде при работе с МТБ-инфекцией.
2. Бессывороточная среда RPMI: Дополните RPMI 1640 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и 10 мМ HEPES.

2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови из охристой шерсти

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все работы с человеческой кровью (потенциально заразной) внутри шкафа биобезопасности класса II. Перед выбросом дезинфицирующие средства инактивировать остаточные продукты крови с помощью дезинфицирующих средств. В этом случае кровь была получена от здоровых добровольцев. Этот протокол дифференцировки макрофагов in vitro был настроен таким образом, чтобы включать 10 x 10⁶ изолированных PBMCs/донор/лунка. От каждого донора одна охристая оболочка содержит около 50 мл концентрированной лейкоцитарной суспензии, происходящей из цельной крови, которая обычно обеспечивает 500–800 x 10⁶ PBMC, из которых может быть получено примерно 10% или 50–80 x 10⁶ моноцитов.

1. Загрузите 15 мл крови охриста поверх 15 мл градиентной среды, приготовленной в пробирке объемом 50 мл. Медленно нанесите кровь поверх слоя градиента плотности, прислонив кончик пипетки к стенке пробирки.
2. Вращайте трубки при давлении 600 x g в течение 25 минут при комнатной температуре (RT) с 0 ускорением и 0 замедлением.
   заметка: Перед центрифугированием тщательно закройте крышки и всегда проверяйте держатели пробирок на предмет возможного распространения после центрифугирования.
3. Удалите верхний слой плазмы с помощью стерильной пипетки Пастера, а затем осторожно соберите слой мононуклеарных клеток в новую пробирку объемом 50 мл с помощью стерильной пипетки Пастера. Добавьте в гранулу PBMC бессывороточную среду RPMI для получения конечного объема 50 мл. Тщательно перемешайте, перевернув пробирку несколько раз перед центрифугированием при 500 x g в течение 5 минут при RT.
4. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте клеточную гранулу, перевернув дно пробирки внутри пальцев.
5. Для удаления загрязнения среды с градиентом плотности из PBMC промывайте ячейки 2–3 раза бессывороточным RPMI до получения конечного объема 50 мл. Центрифугируйте при 500 x g в течение 5 мин при RT. Мойте до тех пор, пока надосадочная жидкость клетки не станет прозрачной.
6. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 20 мл бессывороточной среды RPMI.
7. Подсчитайте клетки с помощью окрашивания трипановым синим, вручную с помощью гемоцитометра или с помощью автоматического счетчика клеток. Разбавляют клеточную суспензию в трипановом синем в соотношении 1:2 или 1:10 путем смешивания образца клеточного трипанового синего в 96-луночном планшете, например, 50 мкл + 50 мкл (для подсчета гемоцитометра) или 10 мкл + 10 мкл (для автоматического подсчета клеток) и подсчитывают клетки для получения количества живых клеток/мл.<бр/> осторожность: Трипановый синий токсичен и должен быть выброшен вместе с отдельными химическими отходами.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Лимфопреп	Alere Technologies AS	11508545
РПМИ 1640	Корпорация «Лайф Технолоджис»	SH30096.01
ЭДТА (0,5 М)	Каролинская университетская больница, Худдинге	Н/Д
На-пируват	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	SH300239.01
L-глютамин	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	SH30034.01
ХЕПЕС	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	SH30237.01
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Сигма-Олдрич	Ф7524