$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Дифференцировка и поляризация клеток, полученных из моноцитов
- Используйте пластическую адгезию для выделения моноцитов. Вкратце, посев свежевыделенных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) в 6-луночный культуральный планшет в соответствующей концентрации, например, 10 x 106 PBMCs/лунка в среду RPMI объемом 2 мл (добавка RPMI 1640 с 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и 10 мМ HEPES) и инкубация при 37 °C и 5%CO2.
- Через 2–3 ч удалите неадгезивные клетки с помощью пипетки и 3 раза промойте лунки 1 мл бессывороточной среды. Прикрепленные клетки являются моноцитами и составляют около 10% от общего количества PBMC, добавленных в лунку, т.е. 106 моноцитов, полученных из 10 x 106 PBMC, добавленных в лунку.
- Для дифференцировки макрофагов готовят рабочий раствор, содержащий 50 нг/мл GM-CSF или M-CSF для поляризации макрофагов M1 и M2 соответственно, добавляют 2 мл полной среды RPMI на лунку. Культивируйте клетки в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C в течение 3 дней.
- На 3-й день осторожно удалите 1 мл среды для клеточных культур из верхнего слоя каждой лунки и дополните клеточные культуры 1 мл свежей полной среды RPMI, содержащей двойную концентрацию M-CSF или GM-CSF, чтобы получить конечную концентрацию 50 нг/мл в лунках. Добавьте факторы роста в готовый рабочий раствор 100 нг/мл/лунку.
- На 6-й день добавляйте различные стимулы в течение последних 18–20 ч дифференцировки клеток, чтобы получить полностью поляризованный и зрелый M1 (интерферон-γ; ИФН-γ и липополисахарид; ЛПС (E. coli O55:B5)) или M2 (интерлейкин 4; IL-4) макрофаги. Для поляризации М1 готовят ИФН-γ и ЛПС в полной среде RPMI (добавка RPMI 1640 с 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES и 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (FBS)) и добавляют 50 мкл на лунку для получения конечной концентрации 50 нг/мл ИФН-γ и 10 нг/мл ЛПС в клеточных культурах. Для поляризации М2 готовят IL-4 в полной среде RPMI и добавляют 50 мкл на лунку для получения конечной концентрации 20 нг/мл в клеточных культурах.
- Для дифференцировки М0 поляризованных макрофагов стимулируйте клетки только М-КСФ, без каких-либо дополнительных цитокинов (обеспечивая М2-подобный фенотип).
- Регулярно проверяйте морфологию клеточных культур, полученных из моноцитов, с помощью световой микроскопии, чтобы убедиться, что более мелкие моноциты дифференцируются в более крупные макрофагоподобные клетки. Кроме того, отслеживаются потенциальные морфологические различия между поляризацией М1 и М2, т.е. удлиненными и растянутыми клетками М1 по сравнению с клетками М2 с более округлой формой.