Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка фидерных ячеек AC-6
Примечание: Линия стромальных клеток AC-6.21 (сокращенно AC-6) (предоставлена И. Вайсманом, Стэнфордский университет) должна поддерживаться в RPMI с добавлением 15% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (FBS). Чтобы служить в качестве фидерных клеток, клетки AC-6 облучают γ 3000 рад (30 Гр) за день до совместного культивирования для предотвращения их пролиферации. Обратите внимание, что клетки AC-6 имеют тенденцию терять свою способность поддерживать дифференцировку, если их оставляют переполненными во время обслуживания или если их количество пассажей превышает 20.
- Промойте клетки AC-6 один раз 1 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS) и удалите DPBS с помощью аспирации. Обрабатывают клетки AC-6 0,8 мл раствора трипсина (0,05 % трипсина и 0,5 мМ ЭДТА в DPBS) в течение 3-5 мин при 37°С, 5% CO2 и затем останавливают реакцию, разбавляя ее 10 объемами питательной среды для получения суспензии одиночных клеток.
- Высевают клетки АС-6 в дозе 5,9x10по 4 клетки/лунку в 12-луночные планшеты и инкубируют их при 37°С, 5% CO2 O/N.
заметка: Плотность ячеек AC-6 очень важна, так как более низкая плотность будет способствовать генерации cDC. Затравка при плотности 5,9х104 ячейки/лунка позволит AC-6 достичь слияния к следующим суток, что является оптимальным для получения pDCs из CLP.
- Облучайте элементы AC-6 при 3 000 рад (30 Гр) с использованием γ-облучателя.
Примечание: Доза, используемая для облучения AC-6, оптимизирована таким образом, чтобы предотвратить пролиферацию клеток и в то же время сохранить их жизнеспособность достаточно долго, чтобы обеспечить цитокины и межклеточный контакт, необходимые для дифференцировки DC из CLP.
- Аспирируйте среду и замените на 1 мл полного RPMI (RPMI с 10% термоинактивированным FBS, 50 мкг/мл гентамицина и 50 мкМ β-меркаптоэтанол).
2. Выделение клеток КМ у мышей
- Принесите мышей в жертву в результате удушьяСО2 и вывиха шейки матки. Поместите мышей на лоток для вскрытия и простерилизуйте их 70% этанолом. Сделайте разрез в средней части живота и удалите кожу с дистальной части мыши, включая кожу, покрывающую нижние конечности.
- Препарируйте мышей в полустерильном капюшоне. Чтобы освободить бедренную и большеберцовую кости, зафиксируйте бедренную кость выше и большеберцовую кость ниже коленного сустава. Отделите мышцы от костей с помощью ножниц и поместите кости в чашку Петри диаметром 6 см, содержащую 5 мл полного RPMI.
- Переехал в стерильную культурную капюшон. Наполните шприц объемом 3 мл, подключенный к игле 27G, полным RPMI. Отрежьте оба конца костей с помощью ножниц и вставьте иглу 27G, чтобы вымыть костный мозг из костей, осторожно вводя полный RPMI по одному разу с каждого конца.
- Приготовьте суспензию для одиночных клеток, аккуратно пипетируя клетки вверх и вниз 3-5 раз в чашке для культивирования с помощью шприца без иглы.
- Центрифугируйте клетки в течение 5 мин при 500 х г и сцедите надосадочную жидкость.
- Лизируют эритроциты с 1 мл буфера ACK (150 мМ NH4Cl, 10 мМ KHCO3, 0,1 мМ ЭДТА) инкубируют в течение 1 мин и останавливают реакцию путем разбавления 10 объемами полного RPMI. Дайте клеткам постоять 5 минут, чтобы под действием силы тяжести измельчить комки мертвых клеток и остатки тканей.
заметка: Не стойте более 5 минут, так как это приведет к потере клеток из-за оседания жизнеспособных клеток.
- Медленно сцеживайте клеточную надосадочную жидкость в новую пробирку, оставляя мусор в исходной пробирке.
- Центрифугируйте в течение 5 минут при давлении 500 x g для гранулирования клеток, затем удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте общее количество клеток БМ (обычно 4-6 x 10,7 клеток БМ получают от одной мыши) в буфере FACS объемом 100 мкл (1x PBS+ 2% FBS+ 1 мМ ЭДТА).
3. FACS-анализ и сортировка CLP
- Добавьте анти-CD16/32 (гибридомный супернантовый клон 2.4G2, 50 μл/реакцию или 1-2 μг/реакцию) в клетки буфера FACS (шаг 2.9) на 1-2 минуты для блокирования Fc-рецепторов.
заметка: Анти-CD16/32 также называют Fc-блоком, который добавляется для предотвращения неспецифического связывания антител с клетками, экспрессирующими Fc-рецепторы, включая гранулоциты, моноциты и В-лимфоциты.
- Одновременно окрашивают клетки следующими флуоресцентными антителами, меченными красителями (для 4x107 клеток) в течение 15 мин на льду, избегая окружающего света. Антитела: ПЭ-конъюгированные маркеры линии (0,2 мкг каждый), включая анти-CD3 (17A2), анти-CD8 (53-6,6,6 г) 7), анти-B220 (RA3-6B2), анти-CD19 (eBio1D3), анти-CD11b (M1/70), анти-Gr-1 (RB6-8C5), анти-Thy1.1 (HIS51), анти-NK1.1 (PK136), анти-TER119 (TER-119) и анти-MHC-II (NIMR-4), 0,2 мкг анти-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 мкг анти-Sca-1-FITC (D7), 0,4 мкг анти-M-CSFR-APC (AFS98) и 0,2 мкг анти-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
- Промойте ячейки 3 мл буфером FACS и центрифугируйте в течение 5 минут при 500 x g.
- Ресуспендируйте элементы в буфере FACS объемом 300 мкл и фильтруйте ячейки через сетчатое фильтр 40 μM.
- Промойте пробирку дополнительным буфером FACS объемом 100 μл, чтобы восстановить оставшиеся клетки, и отфильтруйте в стерильную сортировочную пробирку FACS с помощью того же сетчатого фильтра.
- Проточный цитометрический анализ следует проводить сразу после окрашивания с использованием соответствующих фильтров и напряжений для детектирования сигнала. Используйте лазер с длиной волны волны 488 нм для обнаружения антител, меченных FITC, PerCP-Cy5.5, лазер с длиной волны 561 нм для обнаружения антител, меченных PE и PE-Cy7, и лазер с длиной волны волны 633 нм для обнаружения антител, меченных APC.
- Отсортируйте CLP в соответствии со следующими маркерами: lin-c-kit intSca-1intM-CSFR-IL-7Rα+ (как окрашено в шаге 3.2) с помощью сортировщика клеток. Соберите отсортированные клетки в пробирку объемом 15 мл, содержащую 8 мл полного RPMI в качестве подушки.
- Запишите абсолютное число отсортированных ячеек, отображаемое сортировщиком ячеек в конце прогона. Как правило, 5х104 CLP можно получить из БМ одной мыши.
4. Кокультура CLP и AC-6
- Центрифугируйте отсортированные клетки, начиная с шага 3.7, в течение 10 мин при 500 x g, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу с достаточным количеством RPMI для получения плотности клеток около 5x104 клеток/мл. Засейте 500 клеток/лунку в 12-луночный планшет, содержащий питательные клетки, приготовленные на стадии 1.4.
- Добавьте 100 нг/мл FL (hu-Flt3L-Ig получен на предприятии с использованием системы экспрессии, предоставленной M. Manz, Университетская клиника Цюриха, Швейцария) и инкубируйте при 37°C, 5%CO2 с периодическим визуальным мониторингом развития DC под микроскопом><.
заметка: Коммерчески доступный рекомбинантный человеческий FL или мышиный FL может быть использован в качестве заменителя hu-Flt3L-Ig для поддержки разработки DC.
- Соберите клетки в надосадочную жидкость на 12-й день и промойте лунки один раз 0,5 мл полной среды RPMI, комбинируя полученные надосадочные жидкости. Добавьте 0,5 мл свежей среды и соскребите слипшиеся клетки скребком.
- Соедините клеточную среду из обеих частей и центрифугируйте в течение 5 минут при 500 x g.
- Декантируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в буфере FACS объемом 50 мкл. Добавьте 50 мкл анти-CD16/32 гибридомного надосадочной жидкости и инкубируйте в течение 1-2 мин для блокирования Fc-рецепторов.
- Перечислите и окрасьте все клетки следующими антителами (по 0,05 мкг каждая): анти-CD11c-APC (N418), анти-CD11b-FITC и анти-B220-PE.
- Промойте и центрифугируйте ячейки, как описано в шаге 3.3.
- Ресуспендируйте клетки в 100 мкл буфера FACS, задействуйте CD11c+ и проанализируйте cDCs (CD11c+CD11b+B220-) и pDCs (CD11c+CD11b-B220+).