Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs)
- Приготовление реагента
- Приготовьте PBS/EDTA: фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) и добавьте 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Стерилизуйте этот раствор путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм. ПРИМЕЧАНИЕ Хранить PBS/EDTA при температуре 4 °C и нагревать до комнатной температуры перед использованием.
- Приготовьте буфер для окрашивания: фосфатно-солевой раствор с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты (HEPES) и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Стерилизуйте этот раствор путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм.
- Сбор крови из конуса крови
заметка: Конус крови содержит компоненты лейкоцитов, собранные после тромбоцитфереза из больницы. Если кровь собрана в пробирки с гепарином или ЭДТА, разбавьте кровь PBS в соотношении 1:1 и перейдите к шагу 1.3; если получен охристый слой, разбавьте его с PBS в соотношении 1:2 и перейдите к шагу 1.3.
- Разрежьте два конца конуса, чтобы кровь могла вытекать в пробирку объемом 50 мл.
Учтите, что конус обычно содержит 10 мл крови.
- С помощью шприца с тупым концом, содержащего 30 мл PBS/EDTA, промойте конус и соберите его в пробирку объемом 50 мл.
- Дополнительно разбавьте кровь PBS/EDTA до конечного объема 80 мл.
- Выделение PBMC методом центрифугирования по плотности
- Аликвота по 15 мл по Фиколлу на 4 свежие тюбики по 50 мл.
- С помощью серологической пипетки объемом 25 мл добавьте 20 мл разбавленной крови поверх слоя Фиколла. Обратите внимание, что тюбик объемом 50 мл должен находиться под углом 45 мл, и следите за тем, чтобы не нарушить интерфазу.
- Центрифугируйте пробирки при давлении 805 x g без тормозов в течение 30 мин, 20 °C.
- Снимите слой плазмы и соберите кольцо PBMC, лежащее чуть ниже слоя плазмы, с помощью пипета Пастера. Соедините четыре пробирки PBMC в две пробирки по 50 мл. Обратите внимание, чтобы не собирался прозрачный слой ниже PBMC.
- Добавьте PBS/EDTA до конечного объема 50 мл на пробирку PBMC и центрифугируйте при давлении 548 x g с тормозами в течение 10 мин, 20 °C.
- Асасировать надосадочную жидкость и ресуспендировать гранулы в каждую пробирку с 25 мл красящего буфера и объединить в одну пробирку объемом 50 мл.
- Центрифуга при давлении 367 x g с тормозами в течение 5 мин, 4 °C.
- Аспират надосадочная жидкость и ресуспендированная гранула с 10 мл красящего буфера.
2. Обогащение моноцитов магнитной сепарацией
- Определение номера ячейки
- Возьмите 20 μл клеточной суспензии PBMC и смешайте ее с 20 μл трипанового синего для подсчета количества живых клеток с помощью цитометра.
- Суспензия центрифужных ячеек при 367 x g с тормозами в течение 10 мин, 4 °C.
- Полностью аспиратировать надосадочную жидкость и ресуспендировать клеточную гранулу до концентрации 10 7 клеток на 80 мкл окрашивающего буфера.
- Магнитная маркировка
- Добавьте 20 μл микрогранул CD14 на 10-7 клеток, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 15 минут при температуре 2 - 8 °C.
- Промойте ячейки, добавив 1 мл буфера для окрашивания на 10-7 клеток, и центрифугируйте при 367 x g с тормозами в течение 10 мин, 4 °C.
- Полностью асасировать надосадочную жидкость и ресуспендировать клеточную гранулу в концентрации10-7 клеток на 50 мкл окрашивающего буфера.
- Магнитная сепарация
- Используйте столбец среднего размера максимум для 2 x 10 всего8 ячеек.
заметка: Выберите подходящий столбец и разделитель в соответствии с общим количеством ячеек и количеством ячеек CD14+, рекомендованным в техническом описании.
- Поместите колонку в магнитное поле подходящего сепаратора и подготовьте колонку, промыв ее 500 μл буфера для окрашивания.
- Пипетку суспензируйте клетки на колонку и соберите немеченные клетки, которые проходят через колонку с помощью пробирки объемом 15 мл.
- Замените новую трубку объемом 15 мл под колонку и промойте колонку 3 раза 500 мкл буфера для окрашивания. Убедитесь, что резервуар колонки пуст, прежде чем добавлять новый буфер для окрашивания между стирками.
- Снимите колонку с сепаратора и поместите ее на свежую пробирку объемом 15 мл.
- Нанесите пипеткой 1 мл буфера для окрашивания на колонку. Немедленно промойте ячейки с магнитной меткой, с усилием вставив поршень (входит в комплект) в колонку.
- Повторите шаги с 2.3.2 по 2.3.6, используя элюированную фракцию на новой колонке, чтобы повысить чистоту клеток CD14+. Обратите внимание, что гранулы будут автоматически высвобождаться из клеток в культуре на шаге 3.2.
3. Дифференцировка дендритных клеток в различные состояния активации
- Приготовление реагента (уровень эндотоксина должен быть менее 0,1 ЕЭК/мл во всех реагентах)
- Приготовьте среду для клеточных культур: RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% заменимых аминокислот (NEAA) и 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола (2ME). Стерилизуйте этот раствор путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм.
- Получение цитокинов: восстановление IL-4 и GM-CSF в воде для клеточных культур до концентрации 0,25 мг/мл соответственно в асептических условиях. Аликвотируйте цитокины в микроцентрифужные пробирки объемом 200 мкл и храните их при температуре -80 °C.
- Приготовьте бульон витамина D3: восстановите витамин D3 в воде, пригодной для клеточных культур, до концентрации 100 мМ в асептических условиях. Разложите витамин D3 в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и храните при температуре -20 °C.
- Приготовьте запас дексаметазона: восстановите дексаметазон в воде, пригодной для клеточной культуры, до концентрации 10 мМ в асептических условиях. Аликвота дексаметазона в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и хранить при температуре -20 °C.
- Приготовление ЛПС: восстановите липополисахариды (ЛПС) в воде, пригодной для клеточных культур, до концентрации 1 мг/мл в асептических условиях. Разложите ЛПС в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и храните при температуре -20 °C.
- Генерация различных моДК
- Затравливают 4 набора CD14+ моноцитов в концентрации 0,3 - 0,5 х 106/мл среды для клеточных культур с добавлением 200 нг/мл GM-CSF и 200 нг/мл IL-4 в 6 луночных планшетах. Обратите внимание, что это День 0 и объем среды в каждой 6 лунке составляет 2 мл.
- Инкубируйте клетки в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 °C с 5%CO2.
- Удалите 850 мкл среды из культуры на 4-й день и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Присадочную жидкость и ресуспендирующую гранулу в 1 мл среды для клеточной культуры, содержащей в 2 раза больше (200 нг/мл GM-CSF и 200 нг/мл IL-4). Добавьте эту клеточную смесь обратно в культуру. Обратите внимание, что 2-кратная концентрация, добавленная для GM-CSF и IL-4, станет 1-кратной, когда 1 мл среды будет добавлен обратно в культуру.
- Добавьте 1 мкл витамина D3 и 1 мкл дексаметазона на мл среды в два набора на 5-й день для получения толерогенных moDC. Обратите внимание, что конечная концентрация витамина D3 составляет 100 нМ, а дексаметазона – 10 нМ; добавление GM-CSF и Ил-4 не требуется в 5-й день.
- Добавьте 200 нг/мл GM-CSF и 200 нг/мл IL-4 во все наборы на 6-й день.
- Добавьте 1 мкг/мл ЛПС в один из наборов, обработанных только GM-CSF и IL-4 на 6-й день для получения зрелых moDC.
- Добавьте 1 мкг/мл ЛПС к одному набору толерогенных моДК на 6-й день для получения ЛПС-толерогенных моДХ.
- Соберите различные типы moDC на 7-й день, промыв чашку с культурой PBS, EDTA для проточной цитометрии или других исследований. Обратите внимание, что собираются только неадгезивные клетки. Обратите внимание, что процентный выход из моноцитов CD14+ для незрелых moDC, зрелых moDC, толерогенных moDC и ЛПС-торогенных DC составляет около 90%, 50%, 60% и 60% соответственно и варьируется в зависимости от донора крови и партии FBS.
