Выделение и очистка В-клеток из периферической крови человека

Аннотация

Источник: Tzeng, S. J. Выделение, дифференцировка и количественная оценка В-клеток, секретирующих антитела человека, из крови: ELISpot как функциональное считывание гуморального иммунитета. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео мы демонстрируем выделение В-клеток из периферической крови человека с использованием биотинилированных антител, специфичных для не-В-клеток, и стрептавидин-конъюгированных магнитных микрогранул.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом

1. Выделение и очистка В-клеток периферической крови человека

1. Наберите ~ 10 мл крови из срединной кубитальной вены (в кубитальной ямке перед локтем) в 15-мл пробирку, содержащую K₂ЭДТА (от 1,5 до 2,0 мг/мл крови) и немедленно переверните пробирку несколько раз, чтобы предотвратить образование тромба.
2. Добавьте 35 мл автоклавированного (121 °C, 15 мин) буфера для лизиса эритроцитов (150 мМ NH₄Cl, 10 мМ KHCO₃ и 1 мМ ЭДТА; pH 7,4) в пробирку, содержащую образец свежей крови (≥ 3:1 об/об.) и инкубируйте при комнатной температуре (RT) не более 5 мин.
   заметка: Появление светопропускания через трубку свидетельствует о завершении лизиса эритроцитов.
3. Центрифугируйте при 600 x g при RT в течение 5 мин. Убедитесь, что гранула белого цвета.
4. Ресуспендируйте гранулу 10 мл автоклавного фосфатно-солевого буфера (PBS, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na₂HPO₄ и 1,47 мМ KH₂PO₄; pH 7,4) и центрифугируйте как на стадии 1.3.
5. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу 10 мл среды RPMI 1640 (добавки: 10% сыворотка теленка плода, 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B и 2 мМ L-глутамина), а затем поместите клетки в 10-сантиметровую чашку для культур (10 мл крови на чашку). Поместите чашку в инкубатор с температурой 37 °C и 5%_CO2 на 30 минут.
6. Осторожно переверните чашку для культивирования несколько раз и поместите питательную среду (суспензионные клетки) в пластиковые конические пробирки объемом 15 мл. Отбраковывайте адгезивные клетки (в основном макрофаги) на чашках для культур.
7. Центрифугируйте при 600 x g при RT в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
8. Суспендируйте гранулу с 1 мл среды RPMI 1640. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
   заметка: Жизнеспособность выделенных лейкоцитов обычно превышает 90% при исключении трипанового синего.
9. Центрифугируйте как на шаге 1.7 и ресуспендируйте клетки в ~ 200 мкл холодного буфера PBS (0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мМ ЭДТА) в концентрации 5 - 10 х^{10 6} клеток/мл.
10. Добавьте 5 μл биотинилированного античеловеческого Ab-коктейля, специфичного для клеток крови (при отрицательном отборе В-клеток) на^10-6 клеток и инкубируйте на льду в течение 30 мин.
    заметка: Античеловеческий коктейль Ab должен, по крайней мере, включать Abs, специфичные для CD2 (или CD3), CD14 и CD16.
11. Добавьте в клетки в 10 раз больше избыточного объема стерильного PBS, центрифугируйте при 600 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
12. Добавьте в гранулу равное количество стрептавидин-конъюгированных микрогранул (5 μл на^10-6 клеток) и тщательно перемешайте.
13. Инкубировать на льду в течение 30 минут в пластиковой конической пробирке объемом 15 мл.
14. Добавьте в пробирку 2 мл PBS буфера.
15. Поместите пробирку на магнитную подставку и инкубируйте при RT в течение 8 минут. Коричневые микрошарики будут постепенно прикрепляться к стенке трубки рядом с магнитом.
16. Когда пробирка осталась в магнитной подставке, осторожно переложите надосадочную жидкость в новую стерильную пробирку объемом 15 мл.
17. Повторите шаги с 1.14 по 1.16 и объедините две надосадочные жидкости, содержащие нетронутые В-клетки. Выбросьте микрогранулы.
18. Центрифугируйте при 600 x g при RT в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
19. Суспендировать гранулу в среде RPMI 1640 для последующих экспериментов.
    заметка: Как правило, из 10 мл периферической крови можно выделить 1 - 5 x 10⁵ В-клеток с чистотой более 95%.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	Туба 10 мл
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	Не содержит эндотоксинов
Трипан синий 0,5% раствор	Биологическая промышленность	03-102-1Б	краска
IMag Набор для обогащения В-лимфоцитов человека	BD Biosciences	558007	реагент
Стрептавидин магнитные микрошарики	BD Biosciences	9000810	реагент
Тубы Falcon 15 мл	BD Falcon	352196	Пластиковая посуда
Биотинилированный CD27 mAb	Биолегенда	302804	Клон O323
Биотинилированный античеловеческий CD27	Биолегенда	302804	Клон O323
Биотинилированный античеловеческий CD27	eBioscience	Тел.: 13-0279-80	Клон O323