$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Сортировка клеток для коллекции наивных В-клеток, В-клеток памяти и плазмобластов/плазматических клеток (PB/PC)
- Используя очищенные В-клетки периферической крови человека, определите количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
- Ресуспендируйте клетки в холодном PBS буфере в концентрации 107 мл на мл в полистирольной пробирке объемом 5 мл.
- Добавьте 1 - 2 мкг человеческого IgG на 106 клеток и инкубируйте на льду в течение 10 мин для Fc-блока.
- Добавьте по 1 г анти-CD19-APC (клон: HIB19), анти-CD27-eFluor450 (клон: O323) и анти-CD38-PE (клон: HIT2) на 106 клеток; хорошо перемешайте и инкубируйте на льду в течение 30 минут.
- В последние 5 минут на шаге 1.4 добавьте 5 мкл коммерческого 7-аминоактиномицина D (7-AAD).
- Добавьте 2 мл PBS в пробирку, заворот и центрифугуйте при 600 x g в течение 5 минут.
- Ресуспендируют клетки в сортировочном буфере (стерильный PBS с 2% BSA и 2 мМ ЭДТА) в концентрации 1 - 5 x 107 клеток на мл в 15-мл пробирке.
- Отфильтруйте клетки через нейлоновое сетчатое сетчатое фильтр (размер пор 40 мкм), чтобы удалить клеточные комки.
- Разделите клетки с помощью проточного цитометрического сортировщика, оснащенного тремя лазерами: фиолетовым (405 нм), синим (488 нм) и красным (640 нм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для 3-цветной проточной цитометрии достаточно одного синего лазера.
- Отсортируйте клетки по трем пробиркам объемом 15 мл (содержащим 5 мл среды RPMI) для одновременного сбора наивных В-клеток (CD19+CD27-), В-клеток памяти (CD19+CD27+) и ПБ/ПК (CD19+CD27+/hiCD38+).
заметка: Отсортированные наивные В-клетки и В-клетки памяти могут быть дополнительно культивированы.