Функциональная оценка В-клеток, секретирующих антитела, с помощью анализа ELISpot

Аннотация

Источник: Tzeng, S. J. Выделение, дифференцировка и количественная оценка В-клеток, секретирующих антитела человека, из крови: ELISpot как функциональное считывание гуморального иммунитета. J. Vis. Exp. (2016)

Это видео демонстрирует использование анализа ELISpot для оценки функции В-клеток, секретирующих антитела, ASCs. Антитела, секретируемые ASC, взаимодействуют с мембраносвязанными фрагментами поликлональных антител, которые обнаруживаются фермент-конъюгированными антителами IgG или IgM. Цветное пятно, образующееся в каждой лунке, указывает на наличие изотипа конкретного антитела, который коррелирует с секреторной активностью В-клеток.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

Периферическая кровь человека должна быть получена от здоровых доноров с информированного согласия, и использование образцов крови должно соответствовать утвержденным рекомендациям, установленным наблюдательными советами. В данном исследовании был рассмотрен протокол использования человеческой крови для демонстрации результатов проточной цитометрии (рисунок 1) и анализов ELISpot (рисунок 2).

1. Выделение и очистка В-клеток периферической крови человека

1. Наберите ~ 10 мл крови из срединной кубитальной вены (в кубитальной ямке перед локтем) в 15-мл пробирку, содержащую K₂ЭДТА (от 1,5 до 2,0 мг/мл крови) и немедленно переверните пробирку несколько раз, чтобы предотвратить образование тромба.
2. Добавьте 35 мл автоклавированного (121 °C, 15 мин) буфера для лизиса эритроцитов (150 мМ NH₄Cl, 10 мМ KHCO₃ и 1 мМ ЭДТА; pH 7,4) в пробирку с образцом свежей крови (≥ 3:1 об/об.) и инкубируйте при комнатной температуре (RT) не более 5 мин.
   заметка: Появление светопропускания через трубку свидетельствует о завершении лизиса эритроцитов.
3. Центрифугируйте при 600 x g при RT в течение 5 мин. Убедитесь, что гранула белого цвета.
4. Ресуспендируйте гранулу 10 мл автоклавного фосфатно-солевого буфера (PBS, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na₂HPO₄ и 1,47 мМ KH₂PO₄; pH 7,4) и центрифугируйте как на стадии 1.3.
5. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу 10 мл среды RPMI 1640 (добавки: 10% сыворотка теленка плода, 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B и 2 мМ L-глутамина), а затем поместите клетки в 10-сантиметровую чашку для культур (10 мл крови на чашку). Поместите чашку в инкубатор с температурой 37 °C и 5%_CO2 на 30 минут.
6. Осторожно переверните чашку для культивирования несколько раз и поместите питательную среду (суспензионные клетки) в пластиковые конические пробирки объемом 15 мл. Отбраковывайте адгезивные клетки (в основном макрофаги) на чашках для культур.
7. Центрифугируйте при 600 x g при RT в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
8. Суспендируйте гранулу с 1 мл среды RPMI 1640. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
   заметка: Жизнеспособность выделенных лейкоцитов обычно превышает 90% при исключении трипанового синего.
9. Центрифугируйте как на шаге 1.7 и ресуспендируйте клетки в ~ 200 мкл холодного буфера PBS (0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мМ ЭДТА) в концентрации 5 - 10 х^{10 6} клеток/мл.
10. Добавьте 5 μл биотинилированного античеловеческого Ab-коктейля, специфичного для клеток крови (при отрицательном отборе В-клеток) на^10-6 клеток и инкубируйте на льду в течение 30 мин.
    заметка: Античеловеческий коктейль Ab должен, по крайней мере, включать Abs, специфичные для CD2 (или CD3), CD14 и CD16.
11. Добавьте в клетки в 10 раз больше избыточного объема стерильного PBS, центрифугируйте при 600 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
12. Добавьте в гранулу равное количество стрептавидин-конъюгированных микрогранул (5 μл на^10-6 клеток) и тщательно перемешайте.
13. Инкубировать на льду в течение 30 минут в пластиковой конической пробирке объемом 15 мл.
14. Добавьте в пробирку 2 мл PBS буфера.
15. Поместите пробирку на магнитную подставку и инкубируйте при RT в течение 8 минут. Коричневые микрошарики будут постепенно прикрепляться к стенке трубки рядом с магнитом.
16. Когда пробирка осталась в магнитной подставке, осторожно переложите надосадочную жидкость в новую стерильную пробирку объемом 15 мл.
17. Повторите шаги с 1.14 по 1.16 и объедините две надосадочные жидкости, содержащие нетронутые В-клетки. Выбросьте микрогранулы.
18. Центрифугируйте при 600 x g при RT в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
19. Суспендировать гранулу в среде RPMI 1640 для последующих экспериментов.
    заметка: Как правило, из 10 мл периферической крови можно выделить 1 - 5 x 10⁵ В-клеток с чистотой более 95%.

2. Очистка и отделение В-клеток памяти и наивных В-клеток от изолированных В-клеток

1. Используйте клетки, очищенные с Шага 1, и определите количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
2. Ресуспендирование клеток в 100 мкл холодного PBS буфера после центрифугирования при 600 x g и RT в течение 5 мин.
3. Добавьте 1 - 2 мкг биотинилированного CD27 mAb на 10⁶ клеток и инкубируйте на льду в течение 30 минут.
4. Добавьте в пробирку 10 мл буфера PBS и центрифугируйте при 600 x g в течение 5 минут.
5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 50 мкл PBS буфера.
6. Добавьте равное количество магнитных микрогранул стрептавидина (1 - 2 мкг/10⁶ клеток) в клетки в пластиковой конической пробирке объемом 15 мл.
7. Аккуратно хорошо перемешать и выдерживать на льду в течение 30 минут.
8. Добавьте в пробирку 2 - 3 мл PBS буфера.
9. Поместите пробирку на магнитную подставку и инкубируйте при RT в течение 8 минут, чтобы коричневые микрошарики прикрепились к ближайшей к магниту стороне.
10. Установив трубку в магнитную подставку, осторожно перенесите надосадочную фракцию в новую стерильную пробирку. Эта фракция содержит обогащенные CD27-наивные В-клетки.
11. Добавьте 5 мл в пробирку, содержащую микрогранулы, и мягко суспендируйте микрогранулы (т.е. обогащенную фракцию CD27⁺ В-клеток памяти).
12. Центрифугируйте при 600 x g при RT в течение 5 мин. Суспендируйте гранулы средой RPMI 1640 для последующих экспериментов.
    заметка: Как правило, ~ 30 - 60% В-клеток могут быть очищены как CD27⁺ клетки памяти из PBMC здорового донора.

3. Сортировка клеток для коллекции наивных B-клеток, B-клеток памяти и PB/PC

1. Используя клетки, очищенные из Шага 1, определите номер клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
2. Ресуспендируйте клетки в холодном PBS буфере в концентрации 10⁷ мл на мл в полистирольной пробирке объемом 5 мл.
3. Добавьте 1 - 2 мкг человеческого IgG на 10⁶ клеток и инкубируйте на льду в течение 10 мин для Fc-блока.
4. Добавьте по 1 г анти-CD19-APC (клон: HIB19), анти-CD27-eFluor450 (клон: O323) и анти-CD38-PE (клон: HIT2) на 10⁶ клеток; хорошо перемешайте и инкубируйте на льду в течение 30 минут.
5. В последние 5 минут на шаге 3.4 добавьте 5 μL коммерческого 7-аминоактиномицина D (7-AAD).
6. Добавьте 2 мл PBS в пробирку, заворот и центрифугуйте при 600 x g в течение 5 минут.
7. Ресуспендируют клетки в сортировочном буфере (стерильный PBS с 2% BSA и 2 мМ ЭДТА) в концентрации 1 - 5 x 10⁷ клеток на мл в 15-мл пробирке.
8. Отфильтруйте клетки через нейлоновое сетчатое сетчатое фильтр (размер пор 40 мкм), чтобы удалить клеточные комки.
9. Разделите клетки с помощью проточного цитометрического сортировщика, оснащенного тремя лазерами: фиолетовым (405 нм), синим (488 нм) и красным (640 нм). <бр/> заметка: Для 3-цветной проточной цитометрии достаточно одного синего лазера.
10. Отсортируйте клетки по трем пробиркам объемом 15 мл (содержащим 5 мл среды RPMI) для одновременного сбора наивных В-клеток (CD19⁺CD27^-), В-клеток памяти (CD19⁺CD27⁺) и ПБ/ПК (CD19⁺CD27^+/hiCD38⁺).
    заметка: Отсортированные наивные В-клетки и В-клетки памяти могут быть культивированы, как описано на шаге 4.

4. Дифференцировка in vitro изолированных человеческих CD19+ B клеток, CD19 + CD27+ B клеток памяти и CD19 + CD27- наивных B

клеток

1. Используя клетки, очищенные на шагах 1.19, 2.10, 2.11 и 3.10, определите номер клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
2. Ресуспендируют элементы средой RPMI 1640 в концентрации 1 - 10 х 10⁵ мл и аликвотируют их в лунки 12-луночного планшета.
3. Добавьте CpG (ODN 2006) в концентрации 5 мкг/10^{до 6} клеток/мл.
4. Культивируйте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2 в течение 5 дней.
5. Соберите клетки из каждой лунки, поместите их отдельно в пробирки объемом 15 мл, добавьте 5 мл PBS в каждую пробирку и центрифугируйте их при 600 x g и RT в течение 5 минут.
6. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Ресуспендировать клетки в концентрации 1 - 10 x 10⁵ на мл средой RPMI 1640.

5. Анализ ELISpot

1. Добавьте 30 мкл 35% этанола в дистиллированную воду в каждую лунку планшетов ELISpot на 30 с. <бр/> заметка: При пипетировании никогда не прикасайтесь к мембране в лунках.
2. Переверните пластины ELISpot, чтобы удалить этанол.
3. Налейте 150 мкл автоклавного ddH₂O в каждую лунку и инкубируйте их при RT в течение 5 минут, чтобы смыть остаточный этанол; затем промойте стерильным PBS при RT в течение 3 мин.
   заметка: Шаги с 5.1 по 5.3 могут быть необязательными, в зависимости от изготовления пластин.
4. Поместите 50 мкл 5 мкг/мл поликлонального фрагмента F(ab')₂ античеловеческого Ig (IgG + IgM + IgA) (в PBS) в каждую лунку планшетов ELISpot и инкубируйте их при 4 °C в течение ночи (предпочтительно) или при 37 °C в течение 2 ч.
   заметка: Заклейте края пластин парапленкой до использования.
5. Переверните пластины, чтобы удалить несвязанный АБС, добавьте 200 μL PBS в каждую лунку и инкубируйте их дважды при RT в течение 3 минут каждый раз.
6. Добавьте 200 мкл PBS с 5% BSA (или средой RPMI 1640) в каждую лунку для блокировки и инкубируйте их при RT в течение 2 ч.
7. Переверните пластины, чтобы удалить блокирующий буфер. Промойте каждую лунку дважды 200 μL PBS, как в шаге 5.5.
8. Добавьте по 100 мкл среды RPMI 1640 в каждую лунку и инкубируйте их при 37 °C.
9. Когда будете готовы засеять клетки, переверните планшеты, чтобы удалить среду RPMI 1640.
10. Засейте 100 μL (5 x 10⁴), 50 μL (2,5 x 10⁴) и 25 μL (1,25 x 10⁴) клеток (из этапов 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 и 4.6) в лунки планшета ELISpot. С помощью среды RPMI 1640 доведите объем до 150 мкл/лунка. <бр/> заметка: Рекомендуется как минимум одно или два 2-кратных последовательных разведения для нанесения покрытия на клетки.
11. Инкубируйте планшеты в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2 в течение 8–14 ч. Избегайте перемещения планшетов во время инкубации.
12. Переверните пластины, чтобы удалить элементы и среду RPMI 1640
.
13. Добавьте 200 μл / лунку PBS-T (PBS с 0,05% Tween 20) и инкубируйте их 5 раз при RT, каждый раз в течение 3 мин. Переверните планшет, чтобы удалить буфер для промывки между каждым из 5 стирок.
14. Добавьте в назначенные лунки либо козью античеловеческую IgG-щелочную фосфатазу (АФ), Fcγ-специфичный АБ (для обнаружения IgG, 1:5000 в PBS-T), либо козий античеловеческий IgM-AP, Fcμ-фрагментоспецифичный Abs (для обнаружения IgM, 1:5000 в PBS-T) и инкубируйте в ЛТ в течение 2 ч в темноте.
15. Промойте каждую лунку дважды 200 μL PBS, как в шаге 5.5.
16. Добавьте 50 μл/лунку субстрата субстрата бромхлориндолилфосфат-нитро синего тетразолия (BCIP/NBT). Фиолетовые пятна обычно появляются через 5 - 15 минут.
17. Добавьте 100 μл/лунку ddH₂O, чтобы предотвратить чрезмерное развитие пятен.
18. Промойте пластины проточной водой из-под крана после полного раскрытия всех пятен.
19. Снимите дренаж с пластин и дайте им высохнуть на воздухе в темноте.
20. Подсчитывайте пятна с помощью автоматического считывателя пластин с блоком сбора/анализа изображений (например, автоматическим сканером или вручную с помощью препарирующего микроскопа).
    заметка: Пластины можно хранить в RT в темное время суток и анализировать позже.

Результаты

Рисунок 1. Иллюстрация стратегии стробирования для разделения наивных В-клеток, В-клеток памяти и ПБ в PBMC. (А) Клетки (2 x 10⁶) окрашивали по 2 мкг CD19-APC, CD27-eFluor450 и CD38-PE mAb (шаг 3.4). Компартмент лимфоцитов был закрыт (G1) на точечной диаграмме для прямого рассеяния (FSC) в сравнении с боковым рассеянием (SSC). (B) Клеточные дублеты, образованные двумя слип...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	Туба 10 мл
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	Не содержит эндотоксинов
Трипан синий 0,5% раствор	Биологическая промышленность	03-102-1Б
IMag Набор для обогащения В-лимфоцитов человека	BD Biosciences	558007
Биотинилированный CD27 mAb	Биолегенда	302804	Клон O323
Стрептавидин магнитные микрошарики	BD Biosciences	9000810
Тубы Falcon 15 мл	BD Falcon	352196
Синее сетчатое сетчатое сетчатое фильтр, 40 μм	BD Falcon	352340 (Английский
Античеловеческий CD19-APC	Биолегенда	302212	Клон HIB19
Античеловеческий CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	Клон O323
Античеловеческий CD38-PE-Cy7	Биолегенда	303516	Клон HIT2
Античеловеческий CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	Клон HIT2
Античеловеческий CD45-FITC	Биолегенда	304006	Клон HI30
Античеловеческий CD45-FITC	BD Biosciences	555482	Клон HI30
Антимышиный/крысиный/человеческий CD27-PerCP Cy5.5	Биолегенда	124213	Клон LG.3A10
Античеловеческий CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	Номер 65429	Клон L128
Античеловеческий CD19-FITC	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-098-064	Клон LT19
Античеловеческий CD19-FITC	ГенеТекс	GTX75599	Клон LT19
Античеловеческий CD20-FITC	BD Biosciences	555622	Клон 2H7
Биотинилированный античеловеческий CD27	Биолегенда	302804	Клон O323
Биотинилированный античеловеческий CD27	eBioscience	Тел.: 13-0279-80	Клон O323
7-аминоактиномицин D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006)	ИнвивоГен	TLRL-2006	Тип B CpG
Рекомбинантный человеческий IL-2	ПепроТех	200-02
Рекомбинантный человеческий IL-10	ПепроТех	200-10
Рекомбинантный человеческий ИЛ-21	ПепроТех	200-21
Рекомбинантный человеческий sCD40L	ПепроТех	310-02
Белок А S. aureus Cowan (SAC)	Сигма-Олдрич	82526
Митоген покевид (ШИМ)	Сигма-Олдрич	Л9379
Фильтрующие пластины MultiScreen, размер пор 0,45 мкм	Мерк Миллипор	MSIPS4510	Стерильная, прозрачная фильтрующая пластина на 96 лунок с гидрофобной мембраной из ПВДФ
Решение BCIP/NBT	Сигма-Олдрич	В6404
Одиночный реагент BCIP/NBT, щелочной фосфатазный субстрат	Мерк Миллипор	ЭС006
IgG человека	Иммуноисследования Джексона	009-000-003 (Английский
Человеческий IgG, фрагмент Fc	Иммуноисследования Джексона	009-000-008 (Английский
F(ab')2 фрагмент козьего античеловеческого Ig (IgG+IgM+IgA)	Иммуноисследования Джексона	Тел.: 109-006-127
Козья античеловеческая IgG-щелочная фосфатаза, специфичная для Fcγ-фрагмента	Иммуноисследования Джексона	Тел.: 109-055-008
Козья античеловеческая IgM-щелочная фосфатаза, специфичная для Fcμ фрагментов	Иммуноисследования Джексона	109-055-095 (Английский
Козья античеловеческая IgG-пероксидаза, специфичная для Fcγ-фрагмента	Иммуноисследования Джексона	109-035-008 (Английский
Козья античеловеческая IgM-пероксидаза, специфичная для Fcμ фрагментов	Иммуноисследования Джексона	109-035-095 (Английский
Комплект субстратов BD ELISPOT AEC	BD Biosciences	551951
Анализатор C.T.L. ImmunoSpot	К.Т.Л.