$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка пробирок для сбора
- Приготовьте питательные среды BMSC, дополнив Minimum Essential Medium α (MEM α) 10% сывороткой плода крупного рогатого скота и 1% пенициллином/стрептомицином.
- Поместите 100 μL питательной среды BMSC в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. В одной пробирке обычно помещается 3 косточки, поэтому подготовьте соответствующим образом.
- Отрежьте концы наконечников пипеток объемом 200 мкл настолько, чтобы они поместились в центрифужные пробирки. Вставьте наконечники внутрь пробирок и убедитесь, что крышки могут закрыться, прежде чем ставить пробирки на лед.
заметка: В качестве альтернативы в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл можно вставлять микроцентрифужные пробирки объемом 0,75 мл с отрезанными концами.
2. Сбор костей у мышей
- Усыпьте животных с использованием CO2 с последующим вывихом шейки матки и опрыскайте их 70% этанолом.
заметка: Следите за тем, чтобы использовались животные одного пола и желательно одного возраста. Мы обычно используем животных в возрасте от 7 до 8 недель. Мы рекомендуем объединять клетки не менее чем от 3 животных в каждой экспериментальной группе, чтобы получить более репрезентативную и воспроизводимую популяцию клеток.
- Положите усыпленную мышь на спину на доску для препарирования. С помощью щипцов создайте шатер кожи на животе. Сделайте небольшой надрез (около 1 см) с помощью стерильных ножниц для препарирования. Снимите кожу с конечностей и ступней от разреза, чтобы обнажить нижнюю часть живота и ноги.
- Разрежьте ниже голеностопного сустава, чтобы удалить стопу. Разрежьте вдоль гребня подвздошной кости в области бедра, чтобы отделить головку бедренной кости от тазобедренной кости. Пока мышь все еще лежит на спине, сделайте надрез посередине бедренной кости, чтобы разделить две подвздошные кости.
- С помощью безворсовых салфеток осторожно удалите мышцы бедренных костей, голеней и подвздошных костей.
заметка: Срезание как можно большего количества сухожилий и мышц с кости ускоряет и облегчает очистку с помощью безворсовых салфеток (например, салфеток Кима). Будьте осторожны при работе с костями, так как они имеют тенденцию легко ломаться, а их хрупкость может увеличиваться при определенных генотипах.
- После того, как все образцы будут препарированы, поместите их в PBS на лед и переместите в стерильный капюшон для культуры для оставшихся этапов изоляции.
заметка: Максимально возможная асептическая работа снизит вероятность загрязнения культур.
- Сделайте небольшие надрезы (примерно от 1 до 2 мм) как на проксимальном, так и на дистальном концах костей, прежде чем поместить их в разрезанные кончики в пробирках центрифуги.
заметка: Убедитесь, что вы разрезали достаточное количество, чтобы можно было центрифугировать костный мозг; Тем не менее, необходимо соблюдать осторожность, чтобы не обрезать слишком много, поскольку популяции клеток, как правило, варьируются в зависимости от близости в пространстве костного мозга.
- Центрифуга при давлении 10 000 x g в течение 15 с при комнатной температуре. Убедитесь, что весь костный мозг промывается и гранулируется на дне пробирки объемом 1,5 мл, в то время как кости находятся внутри вкладышей (либо наконечник пипетки объемом 200 мкл, либо микроцентрифужная пробирка объемом 0,75 мл). После того, как весь костный мозг будет собран, извлеките вкладыши с костями из пробирок для сбора.
заметка: Если весь костный мозг промыть, кости будут казаться белыми. Однако, если в определенных костях остается костный мозг, попробуйте снова обрезать концы и центрифугировать.
3. Суспензия клеток
- С помощью иглы 25 G медленно тяните клеточные гранулы вверх и вниз, чтобы разбить комки, и объедините все образцы в одну коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте 10 мл питательных сред BMSC на 500 мкл образцов.
- Поместите фильтр 70 мкм на коническую трубку объемом 50 мл и пропустите клеточную суспензию через этот фильтр, чтобы удалить возможные костные фрагменты.
4. Покрытие и культивирование смешанных популяций клеток костного мозга (всего BMC)
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки культивируются при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2.
- Рассчитайте количество клеток и положите их в соотношении 1,0 x 106 клеток/см2 в питательных средах. Дайте 72 ч смешанной культуры для прикрепления клеток.
заметка: Мы рекомендуем разводить клеточную суспензию в 20 раз в питательных средах и снова разводить в трипановом синем перед подсчетом клеток с помощью гемоцитометра. Для 7-недельных самцов мышей C57Bl6/J мы обычно получаем количество клеток около 50 x 106 клеток, но возраст, пол и штамм могут сильно повлиять на количество клеток.
заметка: Смешанная популяция клеток должна прикрепляться на дне колодца культуры.
- Через 72 часа удалите носитель и замените его свежим носителем. Продолжайте менять носители через день и проверяйте слияние. Когда клетки достигают 80-100% конфлюенции, они готовы к дифференцировке.
заметка: Поскольку эта культура смешивается как с BMSC, так и с ГСК, ее можно непосредственно использовать для остеобластогенеза, адипогенеза, а также остеокластогенеза.
5. Сервировка и культура разделенного населения BMSC (ассоциированных BMSC)
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки культивируются при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2.
- Поместите все клетки, собранные из бедренных, большеберцовых и подвздошных костей одной мыши, в чашку для культуры диаметром 10 см (55 см2 площади культивирования).
заметка: При объединении 2-3 мышей C57BL/6J мы обычно помещаем эту «общую» популяцию костного мозга в колбу размером 150 см2.
- Через 48 ч после смешивания культуры удалить питательные среды (содержащие неадгезивные ГСК). Если необходимо провести эксперименты по остеокластогенезу, отбросьте эту популяцию неадгезивных клеток, если нет, аспирируйте и отбросьте эти клетки.
- Тщательно промойте тарелку/колбу с PBS, чтобы не потревожить прикрепленные элементы.
- Удалите PBS и поднимите клетки, добавив 0,25% трипсина и инкубируя при 37 °C в течение 1-3 мин. Утолите трипсин, добавив клеточную среду в клеточную суспензию. На этом этапе BMSC, которые теперь подняты, могут быть подсчитаны (как это было сделано ранее на шаге 4.1) и покрыты для будущих экспериментов.
- Рассчитайте количество ячеек, необходимых для нанесения покрытия. Центрифугировать необходимый объем клеточной суспензии при 1000 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
заметка: Клетки обычно покрываются на основе экспериментов с конечными точками. Например, если необходимо выделить белок/РНК, мы обычно имеем более высокую плотность (~1,0-2,0 x 106 клеток/лунка в 6-луночном планшете).
- Удалите среду и повторно суспендируйте клеточную гранулу в объеме питательной среды, необходимом для покрытия. Поместите клетки в питательные среды в соответствии с экспериментами и дайте им прикрепиться в течение нескольких дней. Когда BMSC достигнут слияния, приступайте к выполнению дифференцировки.
6. Дифференциация BMSC
- Адипоциты
- Приготовьте базовую среду адипоцитов, смешав 90 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, 10 мл фетальной бычьей сыворотки, 1 мл пенициллина/стрептомицина, 100 мкл 20 мМ росиглитазона и 100 мкл 2 мМ инсулина. При необходимости храните эту среду при температуре 4 °C в течение недели во время эксперимента по дифференцировке.
- Сделайте среду для индукции адипоцитов, добавив 200 мкл 62,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) и 25 мкл 1 мМ дексаметазона к 25 мл базовой среды адипоцитов.
- После того, как культуры BMSC (либо общее количество BMC из шага 4.3, либо адгезивные BMSC из шага 5.6) сливаются, измените среду на среду индукции адипоцитов. Считайте, что этот День 0 дифференциации.
- Через 48 ч удалите среду и освежите культуру средой для индукции адипоцитов.
- На 4-й день переключитесь на адипоцитарные базовые среды.
заметка: Липидные капли могут начать появляться уже на 2-й или 4-й день.
- На 7-й день обратите внимание, что клетки накопили максимальное количество липидных капель и демонстрируют фенотип, похожий на фенотип зрелого адипоцита. Не культивируйте после этого момента, так как это может привести к гибели клеток/отслоению.