Выделение Т-клеток на основе флотации с использованием сортировки клеток, активируемых плавучестью

Аннотация

Источник: Snow, T., et al. Выделение, активация и экспансия Т-клеток на основе флотации из образцов мононуклеарных клеток периферической крови человека с использованием микропузырьков. J. Vis. Exp. (2022)

Это видео демонстрирует выделение Т-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) с использованием технологии функционализированной сортировки клеток, активируемых плавучестью (BACS). Метод выделения включает в себя положительный отбор CD3+ Т-клеток путем мечения клеток биотинилированными анти-CD3 антителами и разделения связанных с антителами клеток с помощью микропузырьков, связанных со стрептавидином.

Протокол

1. Выделение Т-клеток микропузырьками с помощью положительного отбора

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подробно описывает подход к отбору CD3⁺ положительных CD3+ с использованием SAMBs.

1. Инкубировать 3 x 10⁸ коммерчески полученных PBMC в 2,5 мл разделительного буфера с биотинилированным антителом к CD3 (OKT3) в концентрации 25 нг антитела на 1 миллион клеток (25 нг/М). Аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз, и выдерживайте при комнатной температуре в течение 10 минут.
2. Добавьте микропузырьки стрептавидина (SAMBs) в соотношении 0,5 (количество SAMB):1 (количество клеток) в соответствии с концентрацией SAMB, заявленной производителем.
3. Перемешивайте с помощью коммерческого ротатора end-over-end (EOE) при 20 об/мин в течение 10-15 минут при комнатной температуре. Центрифуга в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре.
4. После центрифугирования положительно отобранные клетки будут находиться в верхней части суспензии с SAMBs. Оставшиеся невыбранные клетки будут находиться в клеточной грануле на дне пробирки. С помощью 9-дюймовой стеклянной пипетки вставьте наконечник ниже слоя пузырьковых клеток на дно пробирки, отасуньте клеточную гранулу и субнатант с помощью электронной пипетки и перенесите их в новую пробирку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антитела биотина к человеческому CD3 (OKT3)	Биолегенда	317320 (Английский
Лейкопак	БиоИВТ	HUMANLMX100-0001129
Нормальные человеческие PBMC	БиоИВТ	ЧЕЛОВЕКХЛПБ-0002562
Набор микропузырьков стрептавидина (включает в себя разделительный буфер Академии)	Академия	11110-000

)