Культивирование активированных Т-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови человека

Аннотация

Источник: Mølgaard, K., et al. Мониторинг митохондриального дыхания в цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека в реальном времени. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео мы описываем протокол первичной активации Т-клеток человека. Инкубация наивных Т-клеток с магнитными шариками, покрытыми анти-CD3 и анти-CD28 антителами, с последующим лечением интерлейкином-2 или интерлейкином-15, приводит к активации наивных Т-клеток и их дифференцировке и пролиферации в эффекторные Т-клетки или Т-клетки памяти.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Культивирование активированных первичных Т-лимфоцитов человека

1. Размораживание клеток (День 1)
   1. Предварительно нагрейте 10 мл RPMI 1640 на образец примерно до 37 °C.
   2. Возьмите нужное количество ампул мононуклеарных клеток периферической крови и храните их временно на сухом льду.
   3. Ресуспендируйте замороженные клетки в 10 мл предварительно подогретого RPMI 1640.
   4. Центрифугируйте ячейки в течение 5 мин при 500 x g при RT.
   5. Выбросьте надосадочную жидкость и снова промойте клетки, вернув суспендию в 10 мл RPMI 1640, и центрифугируйте, как описано в 1.1.4.
   6. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в концентрации 2 x 10⁶ клеток на мл среды X-VIVO 15 + 5% сыворотки крови человека (далее: среда для Т-клеток).
   7. Поместите 2 мл клеток в лунку в 24-луночный планшет для культивирования клеток и инкубируйте в течение ночи при 37 °C и 5%_CO2.
2. Активация клеток (день 0)
   1. Промойте гранулы CD3/CD28, переложив 12,5 μл гранул на 1 миллион клеток в микроцентрифужную пробирку. Добавьте 12,5 μL PBS на 12,5 μL гранул.
      заметка: Важно провести вихревое наполнение флакона бусинами перед использованием.
   2. Поместите микроцентрифужную пробирку на подходящий магнит на 1 минуту.
   3. Выбросьте буфер и ресуспендируйте гранулы в исходном объеме Т-клеточной среды (12,5 мкл Т-клеточной среды на 12,5 мкл исходного объема гранул).
   4. Добавьте 12,5 мкл гранул на миллион ячеек, что соответствует соотношению 1:2 (бусины: клетки).
   5. Разделите клетки на два состояния, в каждом из которых будет около 5 миллионов клеток.
   6. Добавьте правильный объем цитокинов к условиям, указанным в таблице 1.
   7. Инкубируйте клетки в течение 3 дней при 37 °C и 5% CO₂.
3. Культивирование клеток (День 3 и 5)
   1. Повторно суспендируйте ячейки и разделите их, перенеся половину объема из каждой лунки в новую лунку. Добавьте в каждую лунку одинаковый объем свежей Т-клеточной среды.
   2. Добавляйте новые цитокины к каждому состоянию, как указано в таблице 1.

	Цитокин	запас	Коэффициент разбавления	последний
Условие 1	Ил-2	3 x 106 Ед/мл	30 000	100 Ед/мл
Условие 2	Ил-15	2 x 105 Ед/мл	2 000	100 Ед/мл

Таблица 1: Получение цитокиновых культур, используемых для управления метаболическими изменениями в Т-клетках.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
24-луночный планшет для культивирования тканей	Нунк	142485
Бусины Anti-CD3xCD28	Gibco	11161Д
Х-ВИВО 15	Лонза	БЭ02-060Ф
Сыворотка крови человека	Сигма Олдрич	Н4522	Нагрев в инактивном состоянии при 56 °C в течение 30 мин
Ил-15	Пепротех	200-02
Ил-2	Пепротех	200-15
Лимфопреп	Технологии стволовых клеток	7801
ПБС	Термо Фишер	10010023
РПМИ 1640	Gibco-Thermo Фишер	61870036
Магнит для шариков DynaMag-2 Магнит	Термо Фишер	12321Д

гг.