Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Выделение одиночной клетки из PDLN
- Поместите стерильную металлическую сетку 250 мкм на коническую пробирку объемом 15 мл в штативе. Промойте сетку 1 мл RPMI.
- Перенесите лимфатические узлы на металлическую сетку и протрите их через сетку с помощью пинцета. Нанесите 1 мл RPMI на металлическую сетку, чтобы промыть клетки в трубку. Повторите еще 3 раза и удалите сетку.
- Центрифугируйте пробирки при давлении 433 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу примерно в 5 мл RPMI. Заполните пробирки с помощью RPMI.
- Центрифугируйте пробирки при давлении 433 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу примерно в 5 мл RPMI. Заполните пробирки с помощью RPMI.
- Центрифугируйте пробирки при давлении 433 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клеточную таблетку в 2 мл РПМИ. Перелейте 2 мл клеточной суспензии в пробирки с круглым дном объемом 5 мл с крышками от клеточного фильтра. Нанесите клеточную суспензию на колпачки клеточного фильтра.
2. Проточная цитометрия
- Центрифугируйте клеточные суспензии из PDLN при 433 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Окрашивают клетки следующими поверхностными антителами в 100 мкл буфера для окрашивания проточной цитометрии (буфер FACS): 0,75 мкг/100 мкл конъюгированного антитела CD4 FITC, 0,60 мкг/100 мкл конъюгированного антитела CD8 APC-H7, 0,30 мкг/100 мкл PE-конъюгированного антитела CD25, 5 мкл (1: 20) APC-конъюгированного антитела Nrp1. Инкубируйте трубки на льду в течение 40 минут.
- Добавьте 200 μL буфера FACS в каждую пробирку. Центрифугируйте пробирки при давлении 433 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторите еще раз.
- Фиксация и пермеабилизация клеток путем ресуспендирования клеточной гранулы в 500 мкл буфера для фиксации пермеабилизации (PFB).
заметка: PFB получают путем смешивания 1 части концентрата фиксации/пермеабилизации с 3 частями разбавителя фиксации/пермеабилизации.
- Храните трубки в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи.
заметка: Инкубация продолжительностью 1 час также работает.
- Центрифугируйте пробирки при давлении 433 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 μл буфера для промывки с пермеабилизацией (PWB). Центрифугируйте пробирки при давлении 433 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
заметка: PWB получают путем разбавления буфера для пермеабилизации (10x) до 1:10 в дистиллированной воде.
- Окрашивают клетки следующими внутриклеточными антителами в 100 мкл PWB: 0,30 мкг/100 мкл PE-Cy7-конъюгированного антитела Foxp3, 4 мкл (1: 25) конъюгированного антитела PacificBlue. Инкубируйте пробирки на льду в течение 1 ч.
- Добавьте 500 μL PWB в каждую пробирку. Центрифугируйте пробирки при давлении 433 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл PWB. Центрифугируйте пробирки при давлении 433 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 300 мкл буфера FACS.
- Проанализируйте клетки на проточном цитометре.
- Стробирование отдельных ячеек на основе Боковой области рассеяния, Высоты и Ширины, а также Прямой области рассеивания, Высоты и Ширины. Запустите один миллион событий для анализа.
- Экспортируйте файлы экспериментов FCS и анализируйте их с помощью программного обеспечения анализатора проточной цитометрии.
