Метод in vitro для дифференцировки мегакариоцитов и образования тромбоцитов

Аннотация

Источник: Perdomo, J., et al. Дифференцировка мегакариоцитов и образование тромбоцитов из CD34+ клеток человека, полученных из пуповинной крови. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует технику дифференцировки мегакариоцитов и образования тромбоцитов. Гемопоэтические стволовые клетки-предшественники, выделенные из пуповинной крови человека, дифференцируются в зрелые мегакариоциты в присутствии тромбопоэтина. Зрелые мегакариоциты продуцируют цитоплазматические расширения, называемые протромбоцитами, которые дают начало отдельным тромбоцитам.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Дифференцировка мегакариоцитов

1. Затравите 5 × 10⁵ клеток/мл CD34⁺ клеток в 2 мл SFM с добавлением 50 нг/мл рекомбинантного человеческого тромбопоэтина (rhTPO) на лунку в 12-луночном планшете. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5%_CO2 в увлажненной атмосфере. Если клетки сливаются до того, как они требуются для анализа, соберите клетки и разделите их на несколько лунок со свежей средой и rhTPO.
   заметка: Две или три лунки должны быть подготовлены специально для контроля дифференциации в разные моменты времени (например, на 7, 9 и 10 день).
2. Соберите клетки из отведенных в сторону лунок для мониторинга дифференцировки, не нарушая клетки в других лунках.
3. Окрашивать клетки 20 мкл антителом против GPIIb/CD41-FITC и 10 мкл антителом против GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 в конечном объеме 100 мкл. Установить контрольную пробирку с использованием соответствующих антител контроля изотипа. Выдерживать в течение 15 - 30 минут при температуре 4 °C.
4. Добавьте 1 мл SB для стирки. Центрифуга при 400 × г в течение 10 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 200 - 300 мкл SB. Проанализируйте с помощью проточной цитометрии.
5. Для каждого флуорофора проанализируйте контроль изотипа, чтобы установить стробирование для FITC и Alexa Flour 647 положительных популяций. Проанализируйте образцы окрашенных клеток, чтобы определить процент двойных положительных клеток CD41⁺/CD42a⁺, которые представляют собой зрелые МК (рис. 1C).
6. Для микроскопической визуализации маркеров клеточной поверхности окрашивают клетки, как описано в. 1.3.
   1. Добавьте 1 мл SB для стирки. Центрифуга при 400 × г в течение 10 мин. Повторно суспендируйте гранулу в 100 μл SB и вращайте на предметном стекле при 1000 x g в течение 5 минут. Зафиксируйте ячейки на предметном стекле, опустив их в метанол на 30 с. Высушите на воздухе, добавьте 20 μL монтажного материала, содержащего DAPI (см. Таблицу материалов), накройте покровным стеклом и визуализируйте с помощью флуоресцентного микроскопа (Рисунок 2A).
7. Для визуализации внутриклеточных антигенов ресуспендировать клетки в PBS и зафиксировать параформальдегидом (конечная концентрация 1%) в течение 15 мин при комнатной температуре. Чтобы пропитать клетки, добавьте тритон-Х 100 (0,1%) и инкубируйте в течение 15 минут. Промойте ячейки 2 мл PBS/0,1% тритон-Х 100. Ресуспендировать в 100 мкл PBS/0,1% тритон-Х 100, добавить антитела против vWf и анти-CD62p (разведение 1:200) и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
   1. Вымойте 2 мл PBS/0,1% triton-X 100 и центрифугируйте при 400 × г в течение 10 минут, повторно суспендируйте в 100 мкл того же буфера и добавьте антимышиный IgG-Alexa 594 и антикроличий IgG-Alexa 488 (1:100). Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, промыть 2 мл PBS/0,1% тритон-Х 100, повторно суспендировать в 100 мкл того же буфера и добавить 20 мкл анти-CD42b-APC. Затем поверните клетки на предметные стекла, как описано в шаге 1.6.1, и подготовьте образцы для микроскопической визуализации, как описано в шаге 1.6.1.
8. Для определения плоидности собирают клетки на 12 или 13 день дифференцировки. Добавьте 1 мл SB для стирки. Центрифугировать при 400 × г в течение 10 мин и окрашивать 20 мкл антител против GPIIb/CD41-FITC в конечном объеме 100 мкл. Инкубировать при 4 °C в течение 30 мин.
   1. Промыть один раз 1 мл SB и повторно суспендировать гранулу в 300 мкл гипотонического цитратного буфера (1,25 мМ цитрата натрия, 2,5 мМ натрия хлорида, 3,5 мМ декстрозы), содержащего 20 мкг/мл йодида пропидия и 0,05% тритона-Х 100. Инкубировать в течение 15 минут при температуре 4 °C в защищенном от света месте.
   2. Добавьте РНКазу до конечной концентрации 20 мкг/мл и инкубируйте в течение 30 мин при 4 °C в защищенном от света месте. Определите интенсивность йодида пропидия с помощью проточной цитометрии путем сбора от 30 000 до 50 000 событий популяции CD41-FITC⁺ (рисунок 2C).

2. Подсчет протромбоцитов, перечисление тромбоцитов и активация тромбоцитов

1. Соберите клетки (начиная с шага 1.1) на 8 или 9 день дифференцировки и семена через 1 × 10⁴ клетки/лунку в 48-луночные планшеты по 200 мкл свежего SFM с добавлением 50 нг/мл рТПО. Посев в течение 5 дней при 37 °C, 5% CO₂,
   заметка: В целях количественного определения затравочные лунки затравливают в трех экземплярах. Такая низкая плотность необходима для визуализации и подсчета протромбоцитарных носителей MK. Протромбоциты обычно начинают появляться через 2 дня посева. Пик приходится на период между 4 и 5 днями.
2. Подсчитайте количество протромбоцитарных МК во всей лунке на микроскопе с инвертированным светом с использованием объективов 10X или 20X.
   заметка: Нагреваемый (37 °C) предметный столик для микроскопа предпочтительнее, так как длительное хранение клеток при комнатной температуре приводит к усадке протромбоцитарных расширений. Протромбоциты наблюдаются в виде длинных продолжений от тела МК. Каждый МК может иметь несколько протромбоцитарных выпячиваний. По мере развития протромбоцитов тело МК уменьшается в размерах.
3. Сборочные ячейки и центрифуга при плотности 400 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Окрашивание клеток 20 мкл античеловеческого антитела к CD41-FITC, как описано в шагах 1.3 и 1.4. Рассчитать процент протромбоцитарного МК (пбМК):
   pbMK (%) = [(Протромбоцитосодержащие MKs/лунка) / (Всего CD41+ клеток/лунка)] x 100
4. Чтобы подсчитать количество тромбоцитов, высвобождаемых в питательную среду, аккуратно перемешайте клетки с помощью пастеровской пипетки и соберите 100 мкл на 14 или 15 день посева.
   1. Окрашивать 20 мкл антителом к человеческому CD41-FITC в течение 20 - 30 мин при 4 °C. Установить контрольную трубку с использованием соответствующего антитела контроля изотипа.
   2. Добавьте 150 μL SB и 50 μL счетных шариков.
   3. Для проточного цитометрического анализа установите FSC и SSC на логарифмическую шкалу. Используйте нормальные тромбоциты крови человека из обогащенной тромбоцитами плазмы, окрашенной CD41-FITC, как описано в разделе 2.4.1 для настройки стробирования тромбоцитов (рис. 3A).
   4. Анализируйте окрашенные тромбоциты путем подсчета шариков с помощью проточной цитометрии. Соберите 1 000 событий подсчета бусин с помощью точечной диаграммы FSC и SSC (рис. 3A). Рассчитайте количество тромбоцитов на основе положительных событий CD41-FITC (рис. 3B) по формуле:
      Тромбоциты на мкл=[(количество положительных событий CD41-FITC)/1 000 бусин)] x [(количество бусин в 50 мкл)/объем образца)]
5. Чтобы проанализировать активацию тромбоцитов, аккуратно перемешайте клетки с помощью пастеровской пипетки и соберите 100 мкл на 14 или 15 день посева. Добавьте 1 мл буфера Тироде (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ MgCl₂, 1,8 мМ CaCl₂, 0,2 мМ Na₂HPO₄, 12 мМ NaHCO₃, 5,5 мМ D-глюкозы, pH 6,5) и центрифугируйте при 200 x g в течение 5 мин к пеллетным элементам.
   1. Соберите надосадочную жидкость и центрифугируйте при давлении 800 x g в течение 10 минут, чтобы гранулировать частицы размером с тромбоциты.
   2. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 100 мкл буфера Tyrode. Добавьте 20 мкл антитела PAC1-FITC и аденозиндифосфата (АДФ) до конечной концентрации 20 мкМ. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 мин. Анализ с помощью проточной цитометрии для определения процента FITC-положительных событий. Используйте свежие человеческие тромбоциты, обработанные таким же образом, как и положительный контроль (рисунок 3C).

Результаты

Рисунок 1: Графики проточной цитометрии выделения CD34+ клеток и дифференцировки MK в культуре. (A) Мононуклеарные клетки (закрытые, как показано на левой панели), очищенные из пуповинной крови человека, окрашивали антителами против CD34-PE для определения процентного соотношения CD34⁺ клеток в образце (1,3%, правая панель). (B) После разделения положитель...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагенты для клеточных культур
Рекомбинантный ТПО человека	Милтеньи Биотек	130-094-013 (Английский
StemSpan SFEM II	Технологии стволовых клеток	9605	Бессывороточная среда для клеток CD34+
Проточная цитометрия и реагенты для окрашивания клеток
PE Мышь против человека CD34	BD Biosciences	340669	Клон 8G12. Это может быть использовано для проверки чистоты CD34. Конечная концентрация антител 1:10 разведение.
PerCP мышиный античеловеческий CD45	BD Biosciences	347464	Разведение 1:10
Контроль изотипов PerCP	BD Biosciences	349044	Разведение 1:10
FITC Мышь против человека CD41a	BD Biosciences	340929	Конечная концентрация антител в соотношении 1:5.
APC Мышь против человека CD42b	BD Biosciences	551061	Это антитело также может быть использовано для обнаружения зрелых MK (процент положительных клеток в обычно ниже, чем при использовании анти-CD42a). Конечная концентрация антител 1:10 разведение.
Alexa Fluor 647 Мышиный античеловеческий CD42a	AbD Serotec	MCA1227A647T	В настоящее время распространяется компанией Bio-Rad. Конечная концентрация антител 1:10 разведение.
Alexa Fluor 647 Мышь с отрицательным контролем	AbD Serotec	MCA928A647	В настоящее время распространяется компанией Bio-Rad. Антитела контроля изотипа
Анти фактор фон Виллебранда кролик поликлональный	Абкам	АВ6994	Разведение 1:200
V450 мышь анти-гумна CD41a	BD Biosciences	No 58425	1:20 разведение
Управление изотипом V450	BD Biosciences	580373	1:20 разведение
Антитела PAC1-FITC	BD Biosciences	340507	Разведение 1:10
Анти CD62p мышиный моноклональный	Абкам	АБ6632	Разведение 1:200
Alexa Fluor 488 козий антикролик IgG	Инвитроген	А11008	Разведение 1:100
Alexa Fluor 594 козий антимышиный IgG	Инвитроген	А11020	Разведение 1:100
Ig Контроль изотипа коктейль-C	BD Biosciences	558659	Антитела контроля изотипа
Йодид пропидия	Сигма Олдрич	П4864
Абсолютные счетные бусины CountBright	Молекулярные зонды, Invitrogen	С36950	Подсчет бусин
материалы
Falcon 5mL полипропиленовые трубки FACS с круглым дном, с защелкивающейся крышкой, стерильные	Технологии in vitro	352063
Стеклянные предметные стекла	Менцель-Глейзер	J3800AMNZ
Монтажный носитель с DAPI	Лаборатория «Вектор	Н-1200	Защита от выцветания монтажного носителя с DAPI
оборудование
Инвертированный микроскоп	Лейка	Инвертированный микроскоп DMIRB
Флуоресцентный микроскоп	Цейсс	Верт.А1
Анализатор клеток	BD Biosciences	FACS Песнь II
Цитоспиновая центрифуга	ТермоСайентиал	Цитоспин 4
программное обеспечение
Программное обеспечение для анализа клеток	BD Biosciences	Программное обеспечение FACS Diva
Программное обеспечение для анализа отдельных клеток	Древовидная звезда	ФлоуДжо
Программное обеспечение для флуоресцентного микроскопа	Цейсс	Zen 2 синяя версия