Трехмерная культуральная система тимуса для получения тимусовых эмигрантов, полученных из ИПСК

Аннотация

Источник: Vizcardo, R., et al. Трехмерная система культивирования тимуса для генерации индуцированных мышиными плюрипотентными стволовыми клетками, полученных из опухолевого антигена, специфичных для тимусовых эмигрантов. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует протокол для генерации функциональных антиген-специфичных Т-клеток из незрелых Т-клеток, полученных из iPSC, с использованием трехмерной системы культивирования тимуса. Совместное культивирование незрелых Т-клеток, полученных из iPSC, с долями тимуса плода плода мышей, истощенных эндогенными лимфоцитами, привело к успешному созреванию Т-клеток с образованием тимусовых эмигрантов (iTEs), полученных из CD8αβ+ MHC класса I+ iPSC.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. 3D Культура органов тимуса для создания iTE

1. Соберите фетальные доли тимуса мыши и разверните эндогенные лимфоциты с помощью лечения дезоксигуанозином (dGUO).
2. На 7-й день лечения dGUO возьмите четыре новые 10-сантиметровые чашки и наполните каждую 20 мл полной среды (Roswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-аланил-L-глутамин + 1x пируват натрия + 1x минимальная незаменимая среда с заменимыми аминокислотами (MEM-NEAA) + 1x пенициллин-стрептомицин + [1:1000] 2-меркаптоэтанол).
3. Переложите все нитроцеллюлозные мембраны с долями тимуса в одну посуду диаметром 10 см. Отделите отдельные доли от мембраны с помощью щипцов, позволяя погрузить их в среду. Откажитесь от мембран. Инкубировать в течение 1 ч при РТ.
4. Переложите доли тимуса в новую 10-сантиметровую чашку с готовой средой и инкубируйте в течение 1 ч при RT. Повторите этот шаг еще 2 раза.
5. С помощью щипцов прикрепите доли тимуса к чашке (по одной), а другой рукой сделайте разрез глубиной 100–200 мкм в центре и удлините половину диаметра доли, чтобы облегчить миграцию предшественника Т-клеток в долю.
6. Перенесите доли тимуса в новую 10-сантиметровую чашку, заполненную полной дифференцировочной средой (полная среда + 5 нг/мл мышиного интерлейкина-7 (IL-7) + 5 нг/мл мышиного Flt3 лиганда (FLT3L) + 5 нг/мл фактора стволовых клеток (SCF)).
7. При необходимости, если вы используете 3D-планшеты для культивирования с сетками нижнего и верхнего уровня, заполните обе сетки стерильным PBS, чтобы предотвратить испарение и высыхание висящих капель.
8. Перенесите 30 мкл готовой среды, содержащей одну обработанную dGuo долю тимуса, с шага 1,6 в каждую лунку 3D-планшета для культивирования.
9. Соберите неадгезивные клетки линии Т (незрелые Т-клетки, полученные из iPSC) из кокультуры OP9/DLL1 (дни 16–21) и ресуспендируйте в соотношении 2–5 x 10^{клеток линии 3} Т на среду объемом 20 мкл.
10. Добавьте 20 мкл суспензии клеток линии Т в каждую долю тимуса в 3D-культуральной пластине. Инкубировать в течение ночи при 37 °C с 5%_CO2.
11. Установите пипетку P200 на 30 мкл и после пипетирования несколько раз отажьте среду из каждой лунки, чтобы удалить все клетки, окружающие доли тимуса. Выбросьте фильтрующий материал и добавьте 30 μL готового фильтрующего материала. Повторите эту процедуру 5-7 раз, чтобы удалить лишние незрелые Т-клетки, которые не мигрируют в доли. После этого меняйте 25–30 мкл среды ежедневно.
12. Подтвердите с помощью световой микроскопии формирование ореола из тимусовых эмигрантов (iTE), полученных из iPSC, вокруг долей, начиная с 4–5-го дня.
13. Ежедневно собирайте iTE с помощью пипетирования сред без прерывания доли. Меняйте носители каждый день и продолжайте сбор в течение примерно 12 дней.
14. Собранные iTE готовы к использованию для молекулярного анализа (рис. 1, рис. 2, рис. 3 и рис. 4) или экспериментов по трансплантации in vivo.

Результаты

Рисунок 1: Иммуногистохимия долей тимуса, засеянных незрелыми Т-клетками, полученными из iPSC. Вверху: H&E окрашивание доли тимуса с посевом и без посева незрелых Т-клеток, полученных из iPSC. Со второго сверху вниз: конфокальные изображения разделенных долей, окрашенных DAPI (ядром), CD3 (Т-клеткой) и слиянием. Масштабные линейки = 100 μм.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-дезоксигуанозин	Сигма-Олдрич	312693-72-4 (Английский
2-Меркаптоэтанол (1,000x)	Thermo Fisher Scientific	21985-023
ФБС	Близнецы	100-500
Лиганд Flt-3	Системы НИОКР	427-ФЛ
Интерлейкин-7	Системы НИОКР	407-МЛ
Раствор заменимых аминокислот MEM	Gibco	11140050
Порошок MEM	Gibco	61100061
Пируват натрия	Thermo Fisher Scientific	11360-070 (Английский)
Фактор стволовых клеток (SCF)	Системы НИОКР	455-МС
Пенициллин/стрептомицин	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Фосфатно-солевой буфер pH 7,4 (1x)	Thermo Fisher Scientific	10010-023
РПМИ 1640	Gibco	11875093
Блюдо 10 см	Корнинг, Инк	353003
Perfecta3D Подвесная откидная пластина	Сигма-Олдрич	HDP1096
щипцы	Дюмон	0108-5PO
OP9/N-DLL1	Биоресурсный центр «Рикен»	Кат# RCB2927; РРИД:CVCL_B220
GlutaMAX (100x)	Thermo Fisher Scientific	35050-061 (Английский)