$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Экспансия NK-клеток из тканей печени (день 0), как показано на рисунке 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исходное количество клеток и жизнеспособность сильно коррелируют со временем, прошедшим с момента удаления органа, и исходным количеством образца ткани. Однако, если поместить ткани в 30 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) и хранить на льду или в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи, NK-клетки все еще могут быть расширены при высокой чистоте и жизнеспособности до 24 часов спустя.
- Определите жизнеспособные участки тканей для получения лимфоцитов из тканей и срезов с помощью стерильного хирургического оборудования.
- Поместите ткани в 30 мл HBSS (без кальция или магния) и держите на льду до тех пор, пока не будете готовы к изоляции.
- Измельчите салфетку в кубики размером <0,5 см с помощью стерильных бритвенных лезвий или ножниц и щипцов внутри шкафа биобезопасности.
- Приготовьте 1x коллагеназу в/в раствор (1 мг/мл), разбавив 10x бульон в HBSS (10x коллагеназа внутривенно: 10 мг/мл или ~200 ЕД/мл).
- Поместите кусочки измельченной ткани в трубки для диссоциатора тканей. Заполните пробирки не более чем 4 г ткани и погрузите кусочки ткани в ~10 мл 1x коллагеназы внутривенно.
заметка: Использование DNase I не рекомендуется, так как это может незначительно снизить жизнеспособность NK и урожайность. Пожалуйста, обратитесь к Таблице материалов для получения информации о конкретных используемых трубках для диссоциатора тканей.
- Поместите трубки для диссоциации тканей в диссоциатор тканей и взбейте при температуре 37 °C, чтобы тщательно измельчить ткань.
заметка: Для ткани печени это может занять более 30 минут. Для более рыхлой ткани может быть достаточно около 15 минут. Пожалуйста, обратитесь к Таблице материалов для конкретных трубок для диссоциатора тканей и используемого диссоциатора тканей.
- Извлеките трубки для диссоциации тканей и растирайте через нейлоновый клеточный фильтр 40 мкм с помощью задней части шприца объемом 5 мл. Соберите элюент и выбросьте крупные непереваренные фрагменты.
- Уменьшите нагрузку на элюент при 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость.
- Повторно суспендируйте клеточные гранулы в 30% поливинилпирролидоне (PVP) диоксиде кремния, чтобы удалить жировые клетки, которые в противном случае загрязнят конечную фракцию лимфоцитов.
- Для приготовления диоксида кремния с покрытием PVP в соотношении 1x в соотношении 9:1 в 10 раз PBS.
заметка: Обратитесь к Таблице материалов для конкретного используемого диоксида кремния с покрытием PVP.
- Чтобы приготовить 30% диоксид кремния с покрытием PVP, разбавьте 1x диоксид кремния с PVP-покрытием PBS/HBSS.
- Уменьшите клеточную гранулу при 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 9 мл среды R-10.
заметка: Состав сред R-10 см. в Таблице материалов.
- Тщательно нанесите клеточную суспензию на 4 мл фильтрующей среды Фиколла или разделительной среды для лимфоцитов, чтобы отделить лимфоциты от эритроцитов и полиморфноядерных клеток.
- Разделите слои центрифугированием при давлении 400 x g в течение 23 минут при комнатной температуре с выключенным ускорением и тормозами или при самой низкой настройке. Осторожно сцедите верхний средний слой и соберите интерфазы, содержащие инфильтрирующие ткани лимфоциты.
- Промойте клетки 10 мл среды и приступайте к подсчету клеток, проточной цитометрии, аликвотированию и замораживанию клеток или протоколу первичной экспансии NK-клеток.
