Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Экспансия NK-клеток из тканей печени (день 0), как показано на рисунке 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исходное количество клеток и жизнеспособность сильно коррелируют со временем, прошедшим с момента удаления органа, и исходным количеством образца ткани. Однако, если поместить ткани в 30 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) и хранить на льду или в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи, NK-клетки все еще могут быть расширены при высокой чистоте и жизнеспособности до 24 часов спустя.
- Определите жизнеспособные участки тканей для получения лимфоцитов из тканей и срезов с помощью стерильного хирургического оборудования.
- Поместите ткани в 30 мл HBSS (без кальция или магния) и держите на льду до тех пор, пока не будете готовы к изоляции.
- Измельчите салфетку в кубики размером <0,5 см с помощью стерильных бритвенных лезвий или ножниц и щипцов внутри шкафа биобезопасности.
- Приготовьте 1x коллагеназу в/в раствор (1 мг/мл), разбавив 10x бульон в HBSS (10x коллагеназа внутривенно: 10 мг/мл или ~200 ЕД/мл).
- Поместите кусочки измельченной ткани в трубки для диссоциатора тканей. Заполните пробирки не более чем 4 г ткани и погрузите кусочки ткани в ~10 мл 1x коллагеназы IV.
заметка: Использование DNase I не рекомендуется, так как это может незначительно снизить жизнеспособность NK и урожайность. Пожалуйста, обратитесь к Таблице материалов для получения информации о конкретных используемых трубках для диссоциатора тканей.
- Поместите трубки для диссоциации тканей в диссоциатор тканей и перемешайте при температуре 37 °C, чтобы тщательно измельчить ткань.
заметка: Для ткани печени это может занять более 30 минут. Для более рыхлой ткани может быть достаточно около 15 минут. Пожалуйста, обратитесь к Таблице материалов для конкретных трубок для диссоциатора тканей и используемого диссоциатора тканей.
- Извлеките трубки для диссоциации тканей и растирайте через нейлоновый клеточный фильтр 40 мкм с помощью задней части шприца объемом 5 мл. Соберите элюент и выбросьте крупные непереваренные фрагменты.
- Уменьшите нагрузку на элюент при 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость.
- Повторно суспендируйте клеточные гранулы в 30% поливинилпирролидоне (PVP) диоксиде кремния, чтобы удалить жировые клетки, которые в противном случае загрязнят конечную фракцию лимфоцитов.
- Для приготовления 1x диоксида кремния с покрытием PVP используйте разбавление 9:1 диоксида кремния с покрытием PVP в 10x PBS.
заметка: Обратитесь к Таблице материалов для конкретного используемого диоксида кремния с покрытием PVP.
- Чтобы приготовить 30% диоксид кремния с покрытием PVP, разбавьте 1x диоксид кремния с PVP-покрытием PBS/HBSS.
- Уменьшите клеточную гранулу при 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 9 мл среды R-10.
заметка: Состав сред R-10 см. в Таблице материалов
- Тщательно нанесите клеточную суспензию на 4 мл фильтрующей среды Фиколла или разделительной среды для лимфоцитов, чтобы отделить лимфоциты от эритроцитов и полиморфноядерных клеток.
- Разделите слои центрифугированием при давлении 400 x g в течение 23 минут при комнатной температуре с выключенным ускорением и тормозами или при самой низкой настройке. Осторожно сцедите верхний средний слой и соберите интерфазы, содержащие инфильтрирующие ткани лимфоциты.
- Промойте клетки 10 мл среды и приступайте к подсчету клеток, проточной цитометрии, аликвотированию и замораживанию клеток или протоколу первичной экспансии NK-клеток.
2. Первичная экспансия NK-клеток из PBMCs (или CB или тканей органов) (день 0), как показано на рисунке 2.
- Разморозьте замороженный PBMC и замороженные, облученные питательные ячейки на водяной бане при температуре 37 °C.
- Промойте PBMC и 100 гамма-облученных (Gy-облученных) ячеек 221-mIL-21 центрифугированием при 400 x g в течение 5 мин 10 мл среды R-10 отдельно.
- Сохранить 1 x 106 клеток PBMC для проточной цитометрии.
заметка: Начальная чистота NK-элемента является важным фактором при расчете скорости расширения NK-элемента.
- Ресуспендируйте клетки в 1 мл среды R-10. Подсчитайте ячейки с помощью Trypan Blue.
- Смешайте 5 x 106 клеток PBMC с 10 x 106 ячейками 100 облученных Гр 221-mIL-21 ячейками в специальном 6-луночном планшете (см. Таблицу материалов).
- Добавьте 30 мл среды R-10 с добавлением человеческого IL-2 (200 Ед/мл) и человеческого IL-15 (5 нг/мл) (см. Таблицу материалов).
- Инкубируйте специальный 6-луночный планшет при 37 °C с 5%CO2.
- Замените среду средой R-10 с добавлением человеческого IL-2 (200 Ед/мл) и человеческого IL-15 (5 нг/мл) для поддержания NK-клеток каждые 3-4 дня><.
заметка: Поддерживайте менее 20 x 106 ячеек на лунку для дальнейшего расширения при каждой смене среды. Для достижения наилучшей жизнеспособности следите за тем, чтобы общее количество ячеек в каждой лунке не превышало 100 х10 6 ячеек.
- Записывайте общее количество клеток, жизнеспособность и проводите проточную цитометрию каждые 3-4 дня для расчета скорости размножения NK-клеток.
