$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка слайдов для приклеивания ячеек Раджи
- Добавьте 150 мкл фибронектина (100 мкг/мл) на лунку в предметное стекло с 8 микролунками (предметное стекло с пластиковым дном камеры) и инкубируйте его в течение от 30 мин до 1 ч при 37 °C. Этот адгезионный субстрат позволяет связывать клетки Раджи с дном лунки (Стадия 2), формировать живые конъюгаты с клетками Юрката (Стадия 4) и захватывать с помощью покадровой микроскопии (Стадия 6), а также совместим впоследствии с необязательной фиксацией параформальдегидом (PFA).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для фиксации ацетона используйте предметные стекла со стеклянным дном камеры и поли-L-лизин (20 мкг/мл) вместо фибронектина, так как ацетон растворяет пластик. Предметное стекло с 8 микролунками (1 см2 лунки, максимальный объем 300 мкл) или эквивалент является гибким и подходящим форматом.
- Аспиратируйте фибронектин с помощью автоматической пипетки объемом 200 мкл и промойте каждую лунку 200 мкл PBS в течение 2 минут с легким встряхиванием. Повторите эту стирку еще раз. На этом этапе предметное стекло камеры можно хранить с PBS в течение 1-2 недель при температуре 4 °C.
2. Адгезия клеток Раджи к предметным стеклам камеры и мечение 7-амино-4-хлорметилкумарином (CMAC)
- Перенесите 10 мл конфлюентной (1-2 x 10 6 клеток/мл) предварительной культуры клеток Raji в пробирку объемом 15 мл с V-образным дном. Хорошо перемешайте и используйте 10 мкл для подсчета ячеек в камере Нейбауэра или аналогичной.
- Центрифугируйте оставшиеся клетки при давлении 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость.
- Осторожно ресуспендируйте клеточную гранулу в теплой сплошной питательной среде (RPMI 1640 с добавлением 10% FCS, 2 мМ глутамина, 10 мМ HEPES, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) в концентрации10-6 клеток/мл. Используйте уравнение, приведенное ниже:
([ ]initial x Vinitial = [ ]final x Vfinal), где [ ]initial представляет начальную концентрацию клеток, Vinitial = начальный объем клеточной суспензии, [ ]final = конечную концентрацию клеток, Vfinal = конечный объем клеточной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от концентрации клеток исходной культуры можно собрать больше клеток, чем необходимо, но важно сохранить оставшиеся клетки в культуре (37 °C) до конца эксперимента, чтобы предотвратить потенциальные проблемы (см. Шаг 2.6).
- Пометьте клетки Раджи, чтобы обеспечить их идентификацию во время формирования синаптического конъюгата. В этом эксперименте мечение 7-амино-4-хлорметилкумарином (CMAC) выполняется на шаге 2.4.2.
- Перенесите необходимое количество клеток Raji в культуральную среду в пробирку объемом 2 мл. Для предметных стекол камеры с 8 микролунками требуется в общей сложности 1,6 мл клеточной суспензии (200 мкл на лунку).
- Добавьте CMAC до конечной концентрации 10 μM. Держите клетки в темноте, накрыв пробирку алюминиевой фольгой, так как CMAC светочувствительна. 200 μL содержит 2 x 10 5 клеток Raji на 1 см2 лунки. Таким образом, если необходимо подготовить 8 лунок, то потребуется 1,6 х 106 ячеек Раджи. <бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка клеток Raji с помощью синего клеточного трекера (CMAC, УФ-возбуждение и синее излучение) отличает их от Th-клеток при образовании синаптических конъюгатов. Этот краситель совместим с PFA и ацетоновыми фиксаторами и позволяет проводить дальнейшие иммунофлюоресцентные процедуры. Старайтесь избегать светового воздействия. Мечение клеток Raji в пуле с CMAC с последующей ресуспендией перед адгезией клеток Raji к предметным стеклам, покрытым фибронектином, обеспечивает однородное мечение клеток Raji с помощью CMAC между различными лунками.
- Ресуспендируйте клетки, окрашенные CMAC, и после аспирации PBS в предметном стекле камеры с шага 1.2 перенесите 200 мкл клеточной суспензии в каждую лунку камерных стекол, покрытых фибронектином, приготовленных на этапах 1.1-1.2. Инкубировать предметное стекло камеры при 37 °C, 5% CO2 в течение 30 мин-1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Адгезия и маркировка CMAC будут происходить одновременно на этом этапе, что экономит время. Имейте в виду, что клетки Raji быстро оседают, поэтому необходимо соблюдать осторожность для поддержания однородной концентрации в клеточной суспензии перед посевом. Промывать CMAC на этом этапе центрифугированием не нужно, так как промывка CMAC будет более простой на шаге 2.7 (когда меченые ячейки Raji уже прилипли к предметным стеклам камеры). Поскольку CMAC присутствует в клеточной суспензии в большом избытке, синий флуоресцентный фон слишком высок, чтобы различить окрашенные в синий цвет клетки. Проверьте флуоресценцию CMAC ячейки на шаге 2.7 после промывки CMAC.
- Убедитесь, что клетки Раджи прилипают к дну лунок, осторожно встряхивая предметные стекла камеры на микроскопе. Убедитесь, что ячейки отображают пробелы друг между другом и не сливаются друг с другом (рис. 1, средняя панель). 50-60% слияние клеток является целесообразным.
- Если большая часть клеток эффективно прилегает к предметному стеклу камеры и зазоров между ячейками не наблюдается, промойте каждую лунку теплой готовой средой и повторно суспендируйте среду автоматической пипеткой объемом 200 мкл для отделения избытка клеток. Проверяйте confluence после каждого этапа ресуспензии.
- Если клетки не прилипают, повторите этап адгезии еще раз и увеличьте время адгезии и/или номер ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь можно остановиться, инкубировать предметное стекло камеры при температуре 37 °C, 5%CO2 в течение ночи (O/N) и продолжить работу по протоколу на следующий день. Пожалуйста, подтвердите на следующий день, что клетки Raji остаются адгезивными и мечеными CMAC с помощью флуоресцентной микроскопии.
- Еще раз тщательно промойте каждую лунку теплым дополнением RPMI, чтобы устранить избыток CMAC, и проверьте наличие синего излучения с помощью флуоресцентного микроскопа (Рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать использования иммерсионного масла (липкого и вязкого) и масляных объективов с высокой числовой апертурой, можно использовать объективы со сверхдальним расстоянием (т.е. 20x или 40x) для быстрой проверки маркировки CMAC с помощью флуоресцентного микроскопа.
3. Пульс CMAC — меченые клетки Раджи со стафилококковым энтеротоксином Е
- Добавьте стафилококковый энтеротоксин Е (СЭЭ, 1 мкг/мл) в каждую лунку. СЭЭ можно удобно разводить в среде для клеточных культур (рабочий раствор при концентрации 100 мкг/мл) из замороженных масс СЭЭ (1 мг/мл в PBS). Используйте 2 мкл 100-кратного рабочего раствора на 200 мкл микролунки. <бр/>
ВНИМАНИЕ: Используйте перчатки для этого шага и выбросьте использованный наконечник в бокс для биологической опасности.
- Инкубируйте предметное стекло камеры при температуре 37 °C, 5%CO2 в течение не менее 30 минут. Эффект СЭЭ длится не менее 3-4 ч. <бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: СЭЭ может быть добавлен к скважинам в разные моменты времени, когда это необходимо, если планируются различные настройки покадровой съемки (шаг 5) и/или в зависимости от точки начала экспериментов в конечной точке (шаг 6).
4. Подготовка клеток Джурката
- Для этого эксперимента используйте ранее выращенную культуру клеток Jurkat (1-2 x 10,6 клеток/мл). Используйте клетки из стандартной колбы для культур или из предыдущей трансфекции в соответствии со стандартными протоколами электропорации, как описано ранее. Трансфекция клеток Jurkat позволит покадрово визуализировать движение секреторных гранул в живых клетках. Например, при экспрессии GFP-CD63 (маркер MVB) может быть зарегистрировано движение везикул, украшенных GFP-CD63.
- Наблюдайте за клетками под фазово-контрастным микроскопом. Если наблюдается избыток мертвых клеток (>20-30%), проведите центрифугирование по Фиколлю с использованием стандартных протоколов, чтобы устранить избыток мертвых клеток (мертвые клетки демонстрируют более высокую плотность, чем живые) перед использованием (см. Обсуждение).
- Перенесите клетки в пробирку объемом 15 мл, пробирку с V-образным дном и используйте 10 мкл для подсчета с помощью гемоцитометра.
- Центрифугируйте оставшиеся ячейки, как описано в шаге 2.2. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в той же концентрации, что и клетки Raji (1 x 106/мл), используя свежую теплую питательную среду. Выполните шаги 2.2-2.3.
- Поддерживайте клетки Jurkat в культуре (37 °C, 5%CO2) в ожидании Шага 4,
ПРИМЕЧАНИЕ: Во втором варианте (трансфекция) количество живых клеток будет намного меньше, чем в первом. Таким образом, рассмотрите возможность использования большего объема исходной клеточной культуры, чтобы получить достаточное количество клеток для эксперимента. Из 10 x 106 клеток Джурката на одну электропорационную кювету и трансфекцию только 2-4 x 106 клеток Джурката выживут после 48 ч трансфекции, и некоторые из этих клеток будут потеряны на этапе Фиколла. Таким образом, одной электропорационной кюветы, как правило, достаточно для вызова адгезивных импульсных СЭЭ-клеток Раджи из 8 микролунок (требуется 1,6 х 106 трансфицированных клеток Юрката).
5. Совместное засевывание ячеек Раджи и Джурката
- Извлеките из инкубатора предметные стекла, содержащие меченые CMAC, импульсные SEE, адгезивные клетки Раджи, начиная с шага 3.2. Мыть CMAC на этом этапе не нужно, так как ранее это было сделано в Шаге 2.7.
- Тщательно отсасывайте питательную среду каждой лунки, одну за другой, из одного угла лунки с помощью автоматической пипетки объемом 200 мкл. Не допускайте полного пересыхания среды в лунке.
- Немедленно замените среду 200 мкл ресуспендированных клеток Юрката в среде для культивирования клеток (1 x 106/мл), приготовленной на шаге 4.5. Если проводится покадровая съемка, сразу после этого шага переходите к шагу 6, так как клетки Jurkat имеют тенденцию к отложению и образованию синаптических конъюгатов очень быстро. Для удобства микролунки, содержащие импульсные SEE, адгезивные клетки Raji, которые на этой стадии не получают посева клетками Jurkat, следует поддерживать в среде для культивирования клеток до последующей провокационной обработки клетками Jurkat. Это позволит гибко использовать последующие задачи с ячейками Jurkat для дополнительных покадровых или обратных кинетических экспериментальных подходов к конечной точке.
- Если вы собираетесь выполнять интервальную съемку, быстро перейдите к шагу 6. Это включает в себя совместное культивирование в течение 1-2 часов в инкубаторе микроскопа или эквиваленте при 37 °C, 5%CO2, чтобы обеспечить образование синаптических конъюгатов и одновременный получение изображения. Если предполагается анализ конечных точек, но без покадровой съемки, проверьте образование конъюгата после периода совместного культивирования с помощью микроскопа (как на рисунке 1) перед фиксацией клеток.
6. Покадровая визуализация возникающих синаптических конъюгатов
- Подготовьте микроскоп и инкубационную камеру перед визуализацией. Для примера подробные настройки микроскопии показаны на рисунке 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если планируется покадровый эксперимент, все настройки и дополнения микроскопа (камера для культивирования клеток окружающей среды и т.д.) должны быть подготовлены до добавления суспензии Джурката на предметное стекло камеры с адгезивными клетками Раджи. Для коммерческого микроскопа описаны следующие шаги (Таблица материалов). Тем не менее, можно использовать любой инвертированный флуоресцентный микроскоп, оснащенный инкубатором для клеточных культур.
- Используйте микроскоп с 60-кратным погружением в масло и высокой числовой апертурой при визуализации поляризованного трафика.
- Убедитесь, что система автоматической фокусировки включена, и отрегулируйте смещение, чтобы сфокусировать ячейки Раджи, привязанные к нижней поверхности. Пожалуйста, обратитесь к рисунку 1.
- После добавления Джурката в каждую лунку, содержащую прилипшие клетки Раджи на шаге 5.3, быстро найдите предметное стекло камеры микролунки на предварительно нагретом (1-2 ч) настольном инкубаторе микроскопа (т.е. OKOlab) и выберите с помощью микроскопа некоторые положения XY, в которых с большой вероятностью будет зарегистрировано возникающее образование ИС, вызванное, например, попаданием в фокус микроскопа клетки, трансфицированной Юркатом.
- Используйте предварительно нагретый столик для микроскопа, так как было замечено, что температурно стабилизированный предметный столик сохраняет стабильные положения X, Y, Z. Критериями для удобного поля XY являются: хорошо сфокусированные и несливные клетки Raji (т.е. отображающие промежутки между клетками) и наличие трансфицированных клеток Jurkat (это можно проверить, комбинируя коэффициенты пропускания и UV или GFP каналы). Клетки юрката очень быстро (несколько минут) оседают на предметном стекле камеры, и шансы на визуализацию возникающих синапсов со временем уменьшаются (рис. 1). Можно либо закончить эксперимент по истечении определенного времени, либо перейти к этапу 7 и зафиксировать конъюгаты для последующей иммунофлюоресценции и анализов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно выбрать до 16 различных полей микроскопа из 4 различных микролунок для одновременной покадровой съемки с несколькими лунками с соответствующим временным разрешением (1-2 минуты на кадр). Ограничение основано как на количестве, так и на интенсивности (влияющей на экспозицию камеры) различных флуорохромов, подлежащих визуализации (в зависимости от количества экспрессируемых флуоресцентных белков, за исключением CMAC). Одним из способов увеличения частоты кадров является запись для канала CMAC только на одном из каждых "n" временных интервалов для GFP (т.е. n = 8, как показано на рисунке 2), поскольку ячейки Raji прикреплены к дну скважины и не так легко перемещаются как ячейки Jurkat. Кроме того, это положительно сказывается на жизнеспособности клеток, так как частое воздействие ультрафиолетового излучения может повредить клетки. Попробуйте настроить частоту временных кадров на 1 кадр каждые 1 минуту или меньше (т. е. 20 с на кадр, рис. 2), так как поляризация MVB занимает от нескольких минут до нескольких часов. Для выполнения этого многоканального захвата необходим микроскоп, оснащенный моторизованной эпифлуоресцентной турелью и соответствующими полосовыми флуоресцентными фильтрами или их эквивалентами.
