Распознавание CD-маркеров цитокин-индуцированных клеток киллеров человека методом проточной цитометрии

Аннотация

Источник: Hsiao, C. H., et al. Выделение и экспансия цитотоксических цитокин-индуцированных киллер-клеток для лечения рака. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы демонстрируем метод, основанный на проточной цитометрии, для определения доли цитокин-индуцированных Т-клеток-киллеров, CIK-клеток, полученных из мононуклеарной клеточной культуры периферической крови.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Индукция и расширение CIK

1. В день 0 культивируют PBMC (1 x 10⁶) в свежей базальной среде, содержащей 1000 МЕ/мл ИФН-γ, в течение 24 ч в увлажненном инкубаторе для клеточных культур при 37 °C и 5%_CO2.
2. В 1-й день обновите среду свежей базальной средой, содержащей 50 нг/мл антител против CD3, 1 нг/мл rh IL-1α и 1000 Ед/мл rh IL-2. Обновляйте средство каждые 3 дня.
3. На 7-й день обновите среду свежей базальной средой, содержащей 1000 Ед/мл резус-фактора IL-2. Обновляйте среду каждые 3 дня до окончания клеточного роста (14 день).

2. Иммунофенотипирование для оценки клеток CIK

1. Промойте клетки ЦИК 10 мл стерильного PBS. Центрифугировать в течение 10 мин при 300 х г и 18−20 °С, аспирировать надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки 10 мл PBS. Подсчитайте количество клеток и проверьте жизнеспособность клеток с помощью теста исключения трипанового синего.
2. Аликвотируйте клетки CIK в шесть стерильных пробирок объемом 1,5 мл с плотностью ~5–10 x 10⁵ клеток/мл PBS. Промаркируйте и обработайте следующим образом: Пробирка 1, Бланк (без антител); Пробирка 2, добавить 20 мкл изотипа IgG1-FITC; Пробирка 3, добавить 20 мкл изотипа IgG1-APC mAb; Пробирка 4, добавить 20 мкл CD3-FITC; Пробирка 5, добавьте 20 мкл CD56-APC mAb; и пробирку 6, добавьте 20 μл CD3-FITC и 20 μл CD56-APC mAb.
3. Осторожно перемешайте клетки CIK с антителами, осторожно дозируя их вверх и вниз не менее 3 раз стерильной пипеткой объемом 1 мл, а затем инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
4. Центрифугируйте пробирки в течение 10 мин при 300 x g и 18−20 °C. Отсадите надосадочную жидкость и однократно суспензируйте клеточную таблетку 1 мл PBS. Аккуратно пипетируйте их вверх и вниз не менее 3 раз стерильной пипеткой объемом 1 мл.
5. Повторите шаг 2.4.
6. Оставьте пробирки в темноте перед проточным цитометрическим анализом.

3. Распознавание маркеров CD

1. Перенесите клеточную суспензию в стерильную полистирольную трубку с круглым дном объемом 5 мл с крышкой-фильтром (ячейки 100 мкм), аккуратно проведя пипетированием через колпачок. Выложите трубочки на карусель по порядку.
2. Откройте программу для анализа проточной цитометрии и создайте папку для экспериментов. Нажмите кнопку «Новый образец», чтобы добавить образец и пробирку в эксперимент, и назовите пробирки следующим образом: Пробирка 1, Пусто; пробирка 2, изотип IgG1-CD3; пробирка 3, изотип IgG1-CD56; Трубка 4, CD3; Трубка 5, CD56; Трубка 6, CD3CD56.
3. Создание системы фильтрации рассеяния для популяций клеток CIK (рис. 1A).
   1. Выберите Tube 1 (Blank) и нажмите кнопку Dot Plot, чтобы создать график FSC-A/SSC-A. Нарисуйте прямоугольный затвор над всей популяцией клеток с порогом FSC-A >5 x 10⁴, чтобы исключить клеточный мусор.
   2. Выберите параметр SSC-A/SSC-H для новой точечной диаграммы и нарисуйте многоугольный вентиль вокруг всех отдельных ячеек. Выберите параметры Count/FITC (CD3) и Count/APC (CD56) для нового графика гистограммы соответственно. Выберите параметр FITC (CD3)/APC (CD56) для новой точечной диаграммы и нарисуйте четырехквадрантный вентиль для определения четырех субпопуляций.
   3. Запишите данные из 20 000 отдельных клеток в каждом образце. Нажмите кнопку Загрузить образец, чтобы сначала проанализировать образец элемента управления Blank. Идентификация всей популяции клеток CIK с помощью параметров каналов CD56 и CD3.
4. Повторите шаг 3.3 для исследования всех образцов.
5. Откройте файлы, содержащие статистические значения отдельного образца, чтобы проанализировать популяции клеток CIK и повторно распечатать их в файлах анализа.

Результаты

Рисунок 1: Доля CD3⁺CD56⁺ Т-клеток из репрезентативной выборки PBMC.(А) Лимфоциты распознавались по определенному размеру и зернистости. Выбрана популяция одиночных клеток для анализа методом проточной цитометрии. (B) Статистический анализ эффективности расширения CIK от трех здоровых доноров был проведен с использованием t-критерия (*, p < 0,01).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антитела APC Mouse Anti-Human CD56	БД	555518	В159
APC Мышь IgG1, контроль изотипа	БД	555751	МОПЦ-21
Проточный цитометр BD FACSCanto II	БД	338962	СН: R33896202856
Модифицированный Eagle Medium/F12 от Dulbecco	ГиКлон	SH30023.02	Базальная среда для культивирования клеток OC-3
Фетальная бычья сыворотка	ГиКлон	SH30084.03	Для клеточных культур K562 и OC-3. Готовая среда содержит 10% FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	71101700-ЭК	Решение для градиента плотности
FITC Мышиное антитело к человеческому CD3	БД	555332	UCHT1
FITC Мышь IgG1, контроль изотипа	БД	555748	МОПЦ-21
Анти-CD3 mAb человека	Такара	Т210	ОКТ3<бр /> Добавьте 2,5 мл бустера (1 мг/1 мл) в 50 мл индукционной среды. Запас при -80 °C
RPMI1640 средний	Gibco	11875-085 (Английский)	Базальная среда для клеточной культуры K562. Запас при 4 °C