Анализ на выявление секреции интерферона-гамма в лимфоидных органах мышей

Аннотация

Источник: Mazet, J. M., et al. Визуализация производства гамма-интерферона in situ в селезенке мыши после инфекции Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует метод визуализации визуализации in situ секреции интерферона-гамма (ИФН-γ) в селезенке мыши. После бактериальной инфекции и индукции накопления ИФН-γ внутри Т-клеток и естественных киллеров, селезенку собирают у мыши. После получения срезов тканей проводится иммуноокрашивание для визуализации ИФН-γ внутри клеток.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Адоптивный перенос антиген-специфичных CD8+ Т-клеток у мышей

1. Изолируйте овальбумин-специфичные (OVA) CD8⁺ Т-клетки (ОТИ), экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (OTI-GFP) или красный флуоресцентный белок (OTI-RFP) из суспензии лимфатических узлов трансгенных мышей с помощью набора для выделения CD8⁺ Т-клеток мыши в соответствии с инструкциями производителя. Приготовьте клеточную суспензию, раздавив лимфатические узлы с помощью поршня шприца, как описано ранее.
2. Переносите клетки OTI-GFP или OTI-RFP (3 x 10⁶ клеток) реципиентам C57BL/6 дикого типа путем внутривенной инъекции, как описано Cahalan, et al. Используйте мышей в возрасте от 6 до 12 недель><. заметка: Этот шаг является необязательным и требуется только для отслеживания антиген-специфических CD8⁺ Т-клеток.

2. Инфекция Listeria monocytogenes

1. Расширяйте L. monocytogenes, генетически модифицированные для экспрессии OVA (LM-OVA), до экспоненциальной фазы роста в бульоне сердечной инфузии при 37 °C при слабом перемешивании до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,08–0,1, как описано ранее.
2. Введите 100 мкл (максимальный объем = 200 мкл) 0,1–0,5 LD50 LM-OVA, разведенных в фосфатно-солевом буфере (PBS), путем внутривенной инъекции с помощью инсулинового шприца 29 G, реципиентам C57BL/6 дикого типа, несущим клетки OTI-GFP или OTI-RFP, при наличии показаний.
   заметка: В наших руках 0,1 х LD50 LM-OVA соответствует 2 х 10⁴ колониеобразующим единицам (КОЕ). L. monocytogenes, генетически модифицированный для экспрессии OVA, используется для активации ранее перенесенных OTI CD8⁺ Т-клеток, но могут быть использованы и другие штаммы L. monocytogenes.

3. Лечение брефельдином А (БФА) для блокирования секреции цитокинов

1. Введите 250 г БФА в 200 мл ПБС внутрибрюшинно в течение 6 ч до умерщвления мышей с помощью инсулинового шприца 29 г><. заметка: Лиофилизированный БЖК сначала ресуспендируют в диметилсульфоксиде (ДМСО) для получения запаса в концентрации 25 мг/мл. Затем BFA разводят в PBS при комнатной температуре (RT), чтобы избежать кристаллизации перед инъекцией. Ингибирование секреции цитокинов индуцирует накопление IFNγ в клетках. Это имеет решающее значение для обнаружения цитокинов.

4. Сбор урожая селезенки

1. Усыпьте мышей с использованием возрастающей концентрации_CO2 с последующим вывихом шейки матки><. заметка: Следуйте рекомендациям местных учреждений по гуманной эвтаназии мышей.
2. Очистите брюшную полость с помощью 70% этанола, и сделайте надрез ножницами, чтобы сделать надрез на 1–2 см через кожу на левом боку мыши, где находится селезенка. Аккуратно сделайте надрез в брюшине, чтобы обнажить селезенку, и выньте ее пинцетом. Соберите селезенку, стараясь не сдавливать ее щипцами и не разрезать, чтобы не нарушить архитектуру селезенки.

5. Фиксация селезенки параформальдегидом (PFA)

1. Приготовьте фиксирующий раствор, смешав 3,75 мл PBS и 3,75 мл 0,2 М L-лизина. Добавьте 21 мг m-периодата натрия и хорошо перемешайте. Затем добавьте 2,5 мл 4% PFA и 20 мкл 12 N NaOH.
   заметка: Используйте фиксирующий раствор в тот же день и выбросьте излишки. Не храните его. Этот этап фиксации важен, если образец содержит флуоресцентные белки, такие как GFP. Не используйте PFA, содержащую следы метанола, так как он денатурирует флуоресцентные белки.
   осторожность: PFA токсичен, и с ним следует обращаться с осторожностью.
2. Погрузите селезенку в фиксатор и фиксируйте минимум на 4 ч, обычно 16–20 ч при 4°C при легком перемешивании.
3. Выбросьте фиксирующий раствор и добавьте 5 мл PBS в течение 5 минут при осторожном перемешивании.
4. Замените PBS 5 мл свежего PBS и инкубируйте в течение 1 ч при 4 °C при слабом перемешивании.
5. Замените PBS 5 мл 30% сахарозы и инкубируйте в течение 12–24 г.<бр/> заметка: Этот метод помогает поддерживать морфологию тканей. После инкубации с раствором сахарозы орган должен опуститься на дно лунки.

6. Замораживание и секционирование

1. Положите сухой лед в большую емкость и поместите внутрь емкость меньшего размера, содержащую около 50 мл чистого метанола и несколько кусочков сухого льда.
2. Аккуратно вытрите селезенку безворсовой салфеткой.
3. Поместите селезенку в форму для основания, содержащую каплю компаунда оптимальной температуры резки (OCT) на дне. Будьте осторожны, чтобы не образовались пузырьки. Добавьте ОКТ поверх селезенки.
4. С помощью щипцов нанесите форму основания на поверхность метанола, следя за тем, чтобы она не касалась ОКТ. Замораживайте ткань как можно быстрее, чтобы свести к минимуму артефакты.
5. Когда он замерзнет, приступаем к разделке.
   заметка: Замороженная селезенка может храниться при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев.
6. Разрез ткани с помощью криомикротома.
   1. Установите температуру камеры на криостате на -21 °C. Отрежьте участки нужной толщины (обычно около 10 мкм). Этот протокол работает с толщинами до 30 мкм.
7. Соберите срезы на предметные стекла микроскопа (см. Таблицу материалов) и осмотрите визуально.
   заметка: Секции могут храниться при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев.

7. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Позвольте разделу прийти на RT.
2. Нарисуйте круг с помощью блокатора жидкости (например, ПАП-ручки) вокруг участка ткани. Рисуйте за пределами ОКТ, иначе он не прилипнет.
3. После высыхания регидратируйте образец, поместив PBS на срез ткани на 5 мин.
   заметка: Объем, помещаемый на секцию, зависит от размера секции. Обычно мы используем 100–300 μл. Не позволяйте секциям высыхать после того, как они увлажнятся.
4. Промойте PBS не менее двух раз, чтобы убедиться, что секция хорошо прилегает к предметному стеклу.
5. Добавьте в раздел блокирующий раствор для уменьшения неспецифического связывания антител.
   1. Приготовьте блокирующий раствор следующим образом: PBS с 0,1% Triton X100, 2% эмбриональной сывороткой теленка (FCS), блокатором рецепторов Fc 2,5 мкг/мл (антимышиный CD16/32). Затем добавьте 2–5% нормальной сыворотки вида каждого вторичного антитела окрашивающей панели.
      заметка: Если антитела непосредственно конъюгированы/биотинилированы, добавьте 5% нормальной сыворотки каждого вида каждого первичного антитела. Если первичное антитело и одно из вторичных антител принадлежат одному и тому же виду (например, первичное антитело, выращенное у кролика, и вторичное антитело против крыс, не используйте нормальный вид сыворотки, так как это усилит фоновый сигнал.
   2. Аккуратно извлеките PBS из среза с помощью аспирации и добавьте 100 мкл блокирующего раствора на каждый срез образца. Инкубируйте в закрытой влажной камере не менее 1 ч при RT.
6. Окрашивание первичными антителами.
   1. Разведите первичные антитела в оптимальной концентрации в блокирующем растворе. Общая начальная концентрация антител составляет 5 мкг/мл, но она должна быть оптимизирована для каждого антитела и ткани.
      заметка: Если антитела непосредственно конъюгированы, смесь антител центрифугируется при 17,135 x g (13,500 об/мин) в течение 15 мин при 4 °C перед использованием. Флуорофоры могут выпадать в осадок. На этом этапе осадки будут окапываться и тем самым предотвращать неспецифическое осаждение осажденных антител на предметном стекле.
   2. Замените блокирующий раствор первичной смесью антител для каждого образца.
   3. Инкубировать в течение 4 ч при RT или в течение ночи (OVN) при 4 °C в закрытой влажной камере.
7. Проведите промывку.
   1. Приготовьте буфер для стирки, добавив 2% FCS в PBS.
   2. Промойте 4 раза с буфером для промывки: один быстрый (без инкубации), один в течение 10 минут и два в течение 5 минут. Затем выполните окончательную промывку PBS в течение 5 минут.
8. Окрашивание вторичными антителами.
   1. Развести представляющие интерес вторичные антитела в оптимальной концентрации в блокирующем растворе. Центрифугируйте смесь, как описано для первичных антител.
   2. Удалите окончательный раствор для стирки. Добавьте вторичную смесь антител в верхнюю часть среза и инкубируйте в течение 1–4 ч при ЛТ в закрытой влажной камере.
9. Промойте 4 раза с буфером для промывки: один быстрый (без инкубации), один в течение 10 минут и два в течение 5 минут. Затем выполните окончательную промывку PBS в течение 5 минут.
10. Удалите окончательный раствор для стирки. Дайте PBS испариться, но не пересушивайте секцию. Поместите каплю монтажного носителя поверх образца и осторожно поместите поверх него покровное стекло. Монтажная среда должна восстанавливать всю секцию. Пусть это полимераза ОВН в РТ защищена от света.<бр /> заметка: Нарисуйте круг вокруг сечения на обратной стороне предметного стекла перед нанесением монтажного материала. После нанесения монтажной среды ткань может стать трудно различимой.
11. Храните предметные стекла в темноте при температуре 4 °C до тех пор, пока они не будут готовы к изображению.

8. Визуализация и анализ

1. Проведите визуализацию окрашивания с помощью конфокального микроскопа.
   заметка: В этом протоколе использовался инвертированный спектральный лазерный сканирующий микроскоп (см. таблицу материалов) вместе с объективами 10x/NA 0,40 или 60x/NA 1,4 (для анализа субклеточной локализации цитокинов). Длины волн возбуждения и излучения отображаются для каждого флуорофора и флуоресцентного белка в Таблице материалов.
2. При необходимости выполняйте анализ и количественную оценку с помощью программного обеспечения для обработки изображений (например, в Имарисе или Фиджи).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Брефельдин А	Кембриджские бионауки	CAY11861
Параформальдегид	Агар научный	Р1018
L-лизина дигидрохлорид	Сигма для медико-биологических наук	Л5751
Метапериодат натрия	Термо Сайентиал	No 20504
D(+)-сахароза	VWR Химикаты	No 27480.294
Прецизионные салфетки для бумаги Kimtech science	Компания Kimberly-Clark Professional	75512
Компаунд O.C.T., монтажная среда для криотомии	VWR Химикаты	361603Э
Блок Fc, очищенный антимышиный CD16/32, клон 93	Биолегенда	101302	Используемый клон антитела и концентрация: 2,5 мг/мл
Предметные стекла для микроскопа - Superfrost Plus	VWR Химикаты	631-0108
анти-CD169 - AF647	Биолегенда	142407	Используемый клон антитела и концентрация: клон 3D6.112 1,6 мг/мл
			Длина волны возбуждения: 650
			Длина волны излучения: 65
анти-F4/80 - БТР	Биолегенда	123115	Используемый клон антитела и концентрация: клон BM8 2,5 мг/мл
			Длина волны возбуждения: 650
			Длина волны излучения: 660
анти-B220 - PB	Биолегенда	103230 (Английский	Используемый клон антитела и концентрация: клон RA3-6B2 1,6 мг/мл
			Длина волны возбуждения: 410
			Длина волны излучения: 455
анти-ИФНг - биотин	Биолегенда	505804	Клон антитела и используемая концентрация: клон XMG1.2 5 мг/мл
анти-ИФНГ - BV421	Биолегенда	505829	Клон антитела и используемая концентрация: клон XMG1.2 5 мг/мл
			Длина волны возбуждения: 405
			Длина волны излучения: 436
анти-Nkp46/NCRI	Системы НИОКР	АФ2225	Используемый клон антител и концентрация: козий 2,5 мг/мл
антикозий IgG-FITC	Новусбио	НПп 1-74814	Клонирование антител и используемая концентрация: 1 мг/мл
			Длина волны возбуждения: 490
			Длина волны излучения: 525
Стрептавидин - ПЭ	Биолегенда	405203	Используемый клон антитела и концентрация: 2,5 мг/мл
			Длина волны возбуждения: 565
			Длина волны излучения: 578
стрептавидин - FITC	Биолегенда	405201	Используемый клон антитела и концентрация: 2,5 мг/мл
			Длина волны возбуждения: 490
			Длина волны излучения: 525
Флюоромоунт G	SouthernBiotech	0100-01
Защитные стекла 22x40мм	Менцель-Глейзер	12352128
Блокиратор жидкости super PAP PEN mini	Аксора	CAC-DAI-PAP-S-M
Imaris - Программное обеспечение для анализа изображений для микроскопии	Битовая плоскость
Конфокальный микроскоп - Olympus FV1200 Лазерный сканирующий микроскоп	Олимп
Криостат - CM 1900 UV	Лейка
Базовая форма одноразовая	Фишер Сайентиал Великобритания Лтд	11670990
ПБС 1Х	ООО «Лайф Технолоджис	20012068
Бульон BHI	Бренд VWR	303415ZA
GFP			Длина волны возбуждения: 484
			Длина волны излучения: 507
Запрос предложений			Длина волны возбуждения: 558
			Длина волны излучения: 583
Инсулиновый шприц, с иглой, 29Г	VWR Интернэшнл	BDAM324824
C57BL/6 мыши дикого типа	Чарльз Ривер