Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Адоптивный перенос антиген-специфичных CD8+ Т-клеток у мышей
- Изолируйте овальбумин-специфичные (OVA) CD8+ Т-клетки (ОТИ), экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (OTI-GFP) или красный флуоресцентный белок (OTI-RFP) из суспензии лимфатических узлов трансгенных мышей с помощью набора для выделения CD8+ Т-клеток мыши в соответствии с инструкциями производителя. Приготовьте клеточную суспензию, раздавив лимфатические узлы с помощью поршня шприца, как описано ранее.
- Переносите клетки OTI-GFP или OTI-RFP (3 x 106 клеток) реципиентам C57BL/6 дикого типа путем внутривенной инъекции, как описано Cahalan, et al. Используйте мышей в возрасте от 6 до 12 недель><.
заметка: Этот шаг является необязательным и требуется только для отслеживания антиген-специфических CD8+ Т-клеток.
2. Инфекция Listeria monocytogenes
- Расширяйте L. monocytogenes, генетически модифицированные для экспрессии OVA (LM-OVA), до экспоненциальной фазы роста в бульоне сердечной инфузии при 37 °C при слабом перемешивании до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,08–0,1, как описано ранее.
- Введите 100 мкл (максимальный объем = 200 мкл) 0,1–0,5 LD50 LM-OVA, разведенных в фосфатно-солевом буфере (PBS), путем внутривенной инъекции с помощью инсулинового шприца 29 G, реципиентам C57BL/6 дикого типа, несущим клетки OTI-GFP или OTI-RFP, при наличии показаний.
заметка: В наших руках 0,1 х LD50 LM-OVA соответствует 2 х 104 колониеобразующим единицам (КОЕ). L. monocytogenes, генетически модифицированный для экспрессии OVA, используется для активации ранее перенесенных OTI CD8+ Т-клеток, но могут быть использованы и другие штаммы L. monocytogenes.
3. Лечение брефельдином А (БФА) для блокирования секреции цитокинов
- Введите 250 г БФА в 200 мл ПБС внутрибрюшинно в течение 6 ч до умерщвления мышей с помощью инсулинового шприца 29 г><.
заметка: Лиофилизированный БЖК сначала ресуспендируют в диметилсульфоксиде (ДМСО) для получения запаса в концентрации 25 мг/мл. Затем BFA разводят в PBS при комнатной температуре (RT), чтобы избежать кристаллизации перед инъекцией. Ингибирование секреции цитокинов индуцирует накопление IFNγ в клетках. Это имеет решающее значение для обнаружения цитокинов.
4. Сбор урожая селезенки
- Усыпьте мышей с использованием возрастающей концентрацииCO2 с последующим вывихом шейки матки><.
заметка: Следуйте рекомендациям местных учреждений по гуманной эвтаназии мышей.
- Очистите брюшную полость с помощью 70% этанола, и сделайте надрез ножницами, чтобы сделать надрез на 1–2 см через кожу на левом боку мыши, где находится селезенка. Аккуратно сделайте надрез в брюшине, чтобы обнажить селезенку, и выньте ее пинцетом. Соберите селезенку, стараясь не сдавливать ее щипцами и не разрезать, чтобы не нарушить архитектуру селезенки.
5. Фиксация селезенки параформальдегидом (PFA)
- Приготовьте фиксирующий раствор, смешав 3,75 мл PBS и 3,75 мл 0,2 М L-лизина. Добавьте 21 мг m-периодата натрия и хорошо перемешайте. Затем добавьте 2,5 мл 4% PFA и 20 мкл 12 N NaOH.
заметка: Используйте фиксирующий раствор в тот же день и выбросьте излишки. Не храните его. Этот этап фиксации важен, если образец содержит флуоресцентные белки, такие как GFP. Не используйте PFA, содержащую следы метанола, так как он денатурирует флуоресцентные белки.
осторожность: PFA токсичен, и с ним следует обращаться с осторожностью.
- Погрузите селезенку в фиксатор и фиксируйте минимум на 4 ч, обычно 16–20 ч при 4°C при легком перемешивании.
- Выбросьте фиксирующий раствор и добавьте 5 мл PBS в течение 5 минут при осторожном перемешивании.
- Замените PBS 5 мл свежего PBS и инкубируйте в течение 1 ч при 4 °C при слабом перемешивании.
- Замените PBS 5 мл 30% сахарозы и инкубируйте в течение 12–24 г.<бр/>
заметка: Этот метод помогает поддерживать морфологию тканей. После инкубации с раствором сахарозы орган должен опуститься на дно лунки.
6. Замораживание и секционирование
- Положите сухой лед в большую емкость и поместите внутрь емкость меньшего размера, содержащую около 50 мл чистого метанола и несколько кусочков сухого льда.
- Аккуратно вытрите селезенку безворсовой салфеткой.
- Поместите селезенку в форму для основания, содержащую каплю компаунда оптимальной температуры резки (OCT) на дне. Будьте осторожны, чтобы не образовались пузырьки. Добавьте ОКТ поверх селезенки.
- С помощью щипцов нанесите форму основания на поверхность метанола, следя за тем, чтобы она не касалась ОКТ. Замораживайте ткань как можно быстрее, чтобы свести к минимуму артефакты.
- Когда он замерзнет, приступаем к разделке.
заметка: Замороженная селезенка может храниться при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев.
- Разрез ткани с помощью криомикротома.
- Установите температуру камеры на криостате на -21 °C. Отрежьте участки нужной толщины (обычно около 10 мкм). Этот протокол работает с толщинами до 30 мкм.
- Соберите срезы на предметные стекла микроскопа (см. Таблицу материалов) и осмотрите визуально.
заметка: Секции могут храниться при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев.
7. Иммунофлуоресцентное окрашивание
- Позвольте разделу прийти на RT.
- Нарисуйте круг с помощью блокатора жидкости (например, ПАП-ручки) вокруг участка ткани. Рисуйте за пределами ОКТ, иначе он не прилипнет.
- После высыхания регидратируйте образец, поместив PBS на срез ткани на 5 мин.
заметка: Объем, помещаемый на секцию, зависит от размера секции. Обычно мы используем 100–300 μл. Не позволяйте секциям высыхать после того, как они увлажнятся.
- Промойте PBS не менее двух раз, чтобы убедиться, что секция хорошо прилегает к предметному стеклу.
- Добавьте в раздел блокирующий раствор для уменьшения неспецифического связывания антител.
- Приготовьте блокирующий раствор следующим образом: PBS с 0,1% Triton X100, 2% эмбриональной сывороткой теленка (FCS), блокатором рецепторов Fc 2,5 мкг/мл (антимышиный CD16/32). Затем добавьте 2–5% нормальной сыворотки вида каждого вторичного антитела окрашивающей панели.
заметка: Если антитела непосредственно конъюгированы/биотинилированы, добавьте 5% нормальной сыворотки каждого вида каждого первичного антитела. Если первичное антитело и одно из вторичных антител принадлежат одному и тому же виду (например, первичное антитело, выращенное у кролика, и вторичное антитело против крыс, не используйте нормальный вид сыворотки, так как это усилит фоновый сигнал.
- Аккуратно извлеките PBS из среза с помощью аспирации и добавьте 100 мкл блокирующего раствора на каждый срез образца. Инкубируйте в закрытой влажной камере не менее 1 ч при RT.
- Окрашивание первичными антителами.
- Разведите первичные антитела в оптимальной концентрации в блокирующем растворе. Общая начальная концентрация антител составляет 5 мкг/мл, но она должна быть оптимизирована для каждого антитела и ткани.
заметка: Если антитела непосредственно конъюгированы, смесь антител центрифугируется при 17,135 x g (13,500 об/мин) в течение 15 мин при 4 °C перед использованием. Флуорофоры могут выпадать в осадок. На этом этапе осадки будут окапываться и тем самым предотвращать неспецифическое осаждение осажденных антител на предметном стекле.
- Замените блокирующий раствор первичной смесью антител для каждого образца.
- Инкубировать в течение 4 ч при RT или в течение ночи (OVN) при 4 °C в закрытой влажной камере.
- Проведите промывку.
- Приготовьте буфер для стирки, добавив 2% FCS в PBS.
- Промойте 4 раза с буфером для промывки: один быстрый (без инкубации), один в течение 10 минут и два в течение 5 минут. Затем выполните окончательную промывку PBS в течение 5 минут.
- Окрашивание вторичными антителами.
- Развести представляющие интерес вторичные антитела в оптимальной концентрации в блокирующем растворе. Центрифугируйте смесь, как описано для первичных антител.
- Удалите окончательный раствор для стирки. Добавьте вторичную смесь антител в верхнюю часть среза и инкубируйте в течение 1–4 ч при ЛТ в закрытой влажной камере.
- Промойте 4 раза с буфером для промывки: один быстрый (без инкубации), один в течение 10 минут и два в течение 5 минут. Затем выполните окончательную промывку PBS в течение 5 минут.
- Удалите окончательный раствор для стирки. Дайте PBS испариться, но не пересушивайте секцию. Поместите каплю монтажного носителя поверх образца и осторожно поместите поверх него покровное стекло. Монтажная среда должна восстанавливать всю секцию. Пусть это полимераза ОВН в РТ защищена от света.<бр />
заметка: Нарисуйте круг вокруг сечения на обратной стороне предметного стекла перед нанесением монтажного материала. После нанесения монтажной среды ткань может стать трудно различимой.
- Храните предметные стекла в темноте при температуре 4 °C до тех пор, пока они не будут готовы к изображению.
8. Визуализация и анализ
- Проведите визуализацию окрашивания с помощью конфокального микроскопа.
заметка: В этом протоколе использовался инвертированный спектральный лазерный сканирующий микроскоп (см. таблицу материалов) вместе с объективами 10x/NA 0,40 или 60x/NA 1,4 (для анализа субклеточной локализации цитокинов). Длины волн возбуждения и излучения отображаются для каждого флуорофора и флуоресцентного белка в Таблице материалов.
- При необходимости выполняйте анализ и количественную оценку с помощью программного обеспечения для обработки изображений (например, в Имарисе или Фиджи).
